动物疫病检测技术

分子诊断学20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生。70年代以来，分子生物学已成为生命科学领域最具活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床,在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透,产生了一个崭新的学科方向-分子医学;70年代末,美国科学院院士美籍华裔科学家Kan等应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断,标志着检验诊断进入基因诊断时代。由于基因诊断是从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进行检测,因此实现了疾病的早期诊断,但由于基因诊断方法以现代分子生物学技术为基础并有机整合了细胞学、遗传学、免疫学等技术,使基因诊断更具先进性、精确性和快速,因此大大提高了诊断的特异性和灵敏度。随着基因诊断技术的不断改进和日臻成熟,其涉及领域和应用范围不断扩大,特别是80年代中期聚合酶链反应(PCR)技术的问世以及90年代初人类基因组计划的启动,进一步推动了基因诊断技术的发展。1999年11月,美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了《TheJournalofMolecularDiagnostics》杂志,标志着基因诊断技术已经发展成为一个成熟的学科———分子诊断学。分子诊断学是以分子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。回顾分子诊断学20余年的发展历史,大致经历了3个阶段:(1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断;(2)以PCR技术为基础的DNA诊断,特别是定量PCR和实时PCR的应用,不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量,还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量;(3)以生物芯片(biochip)技术为代表的高通量密集型检测技术,生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等,由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法,不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点,而且具有广阔的应用前景和商业价值,因此成为分子诊断技术领域的一大热点。分子诊断技术的应用针对传染病的分子诊断技术：现有的很多诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷，聚合酶链式反应、单克隆抗体等分子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传染病诊断的水平，使死亡率降低。分子诊断技术在微生物学研究领域已显出优势：细菌鉴定有很多方法，传统方法如表型表达和生物化学技术等，但操作费时和技术复杂。诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周。如果不能对细菌进行快速精确的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素,因而引发无效治疗和细菌耐药性。随着分子生物学的发展，对细菌的分子诊断技术正在成熟。DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种/株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的分型比传统方法更为准确。DNA的分析方法有多种，如定量PCR、分子杂交(包括基因芯片)和DNA序列分析等。而只有DNA序列测定分析是黄金标准。很显然，DNA包含的遗传信息存在于DNA和ATCG排列次序中，搞清ATCG排列次序对DNA分析来说就是终结指标。如对诸如16SRNA和内源RNAseP基因的序列分析可以判断很多不同种类细菌或同种细菌的不同亚种/株系。但16SrRNA基因的序列分析不能用来分析炭疽热细菌,因为anthracis与B1cereus具有同样的16SrRNA序列。对内源的RNAseP基因的序列分析可以判断不同种类细菌或同种细菌的不同亚种。分子诊断技术是新变异的病原体检测的最有效的手段之一。如：SARS。常见的分子诊断方法核酸分析技术PCR5’3’延伸延伸5’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理反向PCR(reversePCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。已知序列未知序列未知序列高浓度引物低浓度引物不对称PCR多重PCR（复合PCR）电泳引物12341234LP-PCR（Labelledprimers)ＰＣＲ观察锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）原位ＰＣＲ：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。ＲＴ－ＰＣＲ：逆转录酶ＤＮＡ聚合酶PCR扩增mRNA杂化双链cDNA荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。

PCR技术是一种敏感性非常高的检测已感染的宿主或带菌者病原的方法,即使只有少量的宿主细胞被感染,PCR以感染的病原微生物DNA与宿主细胞中DNA整合的靶DNA为模板扩增出已知基因序列,也能扩增未整合的病原基因组序列PCR技术在检测疫苗污染中也起到重要的作用。然而,这种方法不能区分活的有机体和死亡的有机体或是不完整的基因组碎片,这可导致结果解释的复杂性和影响PCR在实际检测中的应用。PCR技术在慢性持续性感染的疾病检测中非常有用,如逆转录病毒感染(牛的白血病病毒感染、羊脑炎、关节炎病毒感染等),这些疾病在诊断和预防中存在严重困难是因为被感染动物是一个持续性潜在的传染源。杂交技术核酸杂交技术SouthernBlot将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。

DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色NorthernBlot在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光探针标记技术1标记物：放射性和非放射性两种放射性：P32非放射性：生物素、地高辛素、荧光素

2、标记方法

（1）切口平移法

（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法基因芯片利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究基因芯片（Genechip）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列着DNA探针，因此也被称为微阵列（Microarray）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（cDNA或cRNA）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。蛋白质分析技术WesternBlot原理：抗原抗体反应步骤：SDS电泳转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影免疫印迹主要是在实验室诊断中用于区分或辨别感染性的微生物,而且是以抗原特异性或用已知的抗原来检测特异性抗体。在其他检测方法中的假阳性结果或假阴性结果经常能在免疫印迹实验分析中得到解决。免疫印迹也经常用来辨别单克隆抗体的类型。个别纯化的多肽(或表达的重组蛋白)可以使用免疫印迹转膜的方法进行蛋白活性的检测,也可以用来区分动物血清中的抗体是免疫引起的还是感染引起的。ELISA加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。ABS-ELISA技术（AvidinBiotinsystem-ELISA）亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这