正交设计优化l-苹果酸发酵工艺

正交设计优化l-苹果酸发酵工艺

l-苹果是由生物三氧化反应及其器官乙酰酸反应的中间产物，也是由二氧化碳固定反应的中间产物。在植物的生理代谢过程中，它位于中心位置。它在食品工业、临床医药、化学工业和饲料工业等领域中的应用很活跃都十分重要,充分显示出其积极意义。苹果酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法、转化法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化。20世纪80年代末以来,对转化工艺的研究获得突破,并成功地应用于工业化生产。而发酵法生产苹果酸的研究还未有重大进展,非糖质原料发酵法尚处于实验室水平。糖质原料发酵法工艺中,一步发酵法和混合发酵法都有较大进展,但有关的研究报道尚少。而混合发酵法由于涉及到两种微生物,培养条件要求比较严格,发酵周期较长,产酸率较低,副产物较多。因此,本文采用米曲霉发酵糖质原料生成苹果酸,通过对发酵温度、接种量、起始糖浓度及碳酸钙加入量的优化,以淀粉水解液为原料,其产酸水平最高可达80.6g/L。1材料和方法1.1病毒米曲霉(Aspergillusoryzae)。1.2培养基1.2.1自然ph5.55.5选用PDA培养基:马铃薯培养基200.0g,葡萄糖20.0g,琼脂2.5%,水1000mL,自然pH(5.5~6.5)。将马铃薯洗净,去皮,切成碎块,立即放入水中煮沸1h,用6层纱布过滤,加入葡萄糖和琼脂,加水配成1000mL溶液,加热煮沸、分装试管、加塞标记、高压杀菌后备用。1.2.2酶系统论豆饼粉6.0,蔗糖2.0,NaNO30.3,K2HPO40.1,KCL0.1,MgSO4·7H2O0.03,FeSO4·7H2O0.05。加水至100.0mL,于三角瓶中120℃、0.1MPa湿热灭菌,方法同上。1.2.3khpo,mnso-4,防范khpo3,防范kp3,mnso3.3,4,4.3,4.2,4-5-5-4.3,4.2.3,4.3,4.2研究方法单独灭菌,6.豆饼粉0.5,FeSO4·H2O0.01,CaCl20.01,K2HPO40.01,MgSO4·H2O0.01,MnSO40.05,(NH4)2SO40.2,葡萄糖8.0~13.0,CaCO36.5~8.5(单独灭菌),方法同上。1.3种子培养条件斜面培养条件为培养温度30℃,培养时间24h。种子培养条件为培养温度30℃,培养时间3d,摇瓶转速200r/min。发酵条件为培养温度32~38℃,摇瓶转速200r/min。1.4苹果酸的测定苹果酸定性检测采用三氯化钛法:将5.0mL待测溶液注入试管,再加3滴15%TiCl3试剂。如有白色沉淀产生说明溶液中存在苹果酸,当溶液中含有柠檬酸时以不加热为妥。苹果酸定量检测采用紫外分光光度法:取含样品溶液1.0mL,加入6.0mL分析纯的浓硫酸,再加入0.1mL2,7-萘二酚溶液,接着在100℃水浴中加热15~20min,取出,待冷却至室温后,于385nm下进行比色测定,根据测得的吸光度可以从标准曲线上查得苹果酸含量,将纸层析显色后的样品斑点,剪下后置于1mL水中洗脱,然后将其作为样品溶液按上法处理,也可测得苹果酸含量。此外,用酸度计测定pH,用快速测定法测定残糖。2结果与讨论2.1接种时间对米曲霉菌生长的影响根据米曲霉生长曲线,在培养至30h开始产生孢子,39~75h为指数期,所以发酵接种时间应该控制在米曲霉生长2.5d时。在不同的接种量下,米曲霉菌株产L-苹果酸情况见图1。实验结果表明,接种量为8.0%时产酸率最高。接种量太高会造成菌丝结团从而影响通氧过程,接种量太低会使发酵不充分影响产酸过程。2.2发酵温度对米曲霉产量l-苹果酸的影响在不同的发酵温度下,米曲霉菌株产L-苹果酸情况见图2。从图2可以看出,米曲霉菌株的最适发酵温度范围在34~36℃。2.3淀粉水解液浓度对米曲霉菌产酸的影响米曲霉菌株的碳源适应范围比较广,液化淀粉、葡萄糖、淀粉水解液都是较好的碳源,考虑到以水解糖为原料更有利于产品的后提取,因此选用淀粉水解液为发酵碳源,同时,淀粉原料来源丰富,采用双酶制糖工艺技术成熟、质量可靠。将淀粉水解液配制成不同的浓度,考察米曲霉菌株的产酸情况,结果见表1。实验结果表明,随着糖浓度的增加,产酸逐渐增加,起始糖浓度为100.0g/L时转化率最高。初糖浓度高于此值时,转化率降低,发酵残糖偏高。综合考虑产酸、残糖和发酵周期等指标的前提下,将糖浓度控制在100.0g/L为佳。2.4培养基中caco3对产酸的影响在发酵中碳酸钙会和生成的苹果酸反应生成难溶的苹果酸钙,从而达到减弱对关键酶的反馈抑制,使代谢向着生成和积累苹果酸的方向进行。同时,L-苹果酸与碳酸钙反应放出CO2,为CO2固定支路提供CO2,利于L-苹果酸的生成。因此,培养基中CaCO3的存在是L-苹果酸有效积累的必要条件。CaCO3对产酸的影响实验结果见表2。实验结果表明:碳酸钙用量对产酸的影响较大,培养基中不添加碳酸钙时,几乎不产酸,随着碳酸钙浓度的增加,产酸水平也相应提高,在初糖浓度不变的情况下,碳酸钙适当过量有利于产酸,当碳酸钙的添加超过一定的量时产酸趋于不变。初糖浓度为100g/L时,经实验表明碳酸钙的用量为75g/L比较合适。2.5d、t因素对l-苹果酸主发酵条件的影响在单因子实验的基础上,采用L9(34)正交表安排实验,考察接种量、发酵温度、起始糖浓度和CaCO3添加量4因素对米曲霉发酵生产苹果酸的影响。实验设计和结果见表3、表4。从表4可看出,最优方案为A1B2C2D2,即发酵温度34℃、初糖浓度100g/L、接种量8.0%、碳酸钙添加量75g/L。还知D因素的极差RD=27.1最大,表明D因素对L-苹果酸的产率影响程度最大;A因素的极差RA=2.2最小,说明温度对L-苹果酸产率的影响程度最小;B、C因素的极差居中,说明B、C因素对L-苹果酸产率有一定的影响,但是影响程度较D因素小。3菌株复配和工艺条件对米曲霉最适产酸水平的影响实验中通过对发酵温度、接种量、起始糖浓度及碳酸钙添加量的优化,确定利用米曲霉发酵生产L-苹果酸的最佳工艺条件为发酵温度为34℃、起始糖浓度为100g/L、接种量为8.0%、碳酸钙添加量为75g/L,该条件下最高产酸水平可达80.6g/L。与报道中最高水平有一些差距,分析认为是因所选菌种非高产菌株,一步发酵的关键应该放在选育高产菌株和工艺条件的控制上。另外碳酸钙的加入虽然可以