败酱草总皂甙抗小鼠宫颈癌活性研究

败酱草总皂甙抗小鼠宫颈癌活性研究

宫颈是人类最常见的疾病之一，对女性的健康有很大的影响。对于宫颈癌如今采用最多的是手术治疗和放射治疗,但两者都有着很多副作用且很难根治。中草药在治疗癌症方面的应用已经被越来越多的人关注和研究。败酱草(HerbaPatriniae)为败酱科植物白花败酱(PatriniavillosaJuss)的全草,作为我国传统的中草药,分布于山西、陕西、河南、河北等地,根及全草均可入药,具有清热解毒、消肿排脓和祛瘀止痛的功效,临床上广泛用于急性阑尾炎初起、无名肿痛、宫颈糜烂、癌症。研究表明,败酱草主要含有黄酮醇、齐墩果酸、异香豆素糖苷、多糖和挥发油,其活性成分在体外能抗人宫颈癌(Hela)生长,在体内抑制大肠癌HT-29实体瘤的生长,具有较好的抗肿瘤活性。但是,败酱草总皂甙(saponinsofPatriniavillosa)抗宫颈癌的研究国内外目前尚未见报道。本试验通过建立小鼠U14宫颈癌实体瘤模型,检测肿瘤生长情况及其相关免疫生化指标,以期初步揭示败酱草总皂甙抗宫颈癌的机制,为下一步研究提供依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物、环境败酱草原药材购于河北省秦皇岛市北京同仁堂大药房。昆明种清洁级32只小鼠,6周龄～8周龄,体重20g±2.0g,雌性,北京协和医院实验动物中心提供;试验环境:温度20℃～25℃,相对湿度40%～60%。小鼠宫颈癌(U14)细胞引自中国医学科学院药物研究所,在昆明小鼠腹腔内传代。1.1.2试剂与试剂盒AB-8型大孔树脂由天津南开大学生产,环磷酰胺(CTX)为中美合资山西泰盛制药有限公司产品,临用时用生理盐水配制成所需浓度(25mg/kg);SOD试剂盒、CAT试剂盒和T-AOC试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;化学试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1败酱草皂呤精提物的制备将败酱草全草粉碎,加入盛有700mL/L乙醇的圆底烧瓶中浸泡12h,40℃热回流,减压浓缩除去乙醇得到浸膏。先用石油醚作两相萃取除去杂质,后改用正丁醇萃取,分别萃取3次,合并正丁醇提取液,减压浓缩获得败酱草皂甙粗提物。按说明书预处理AB-8大孔树脂,湿法装柱上样,先用去离子水洗脱至无色,再用700mL/L乙醇以3mL/min流速洗脱至基本无色,收集乙醇相,减压回收乙醇获得洗脱浸膏,再经冷冻干燥得到败酱草总皂甙。1.2.2实体瘤模型和腹水瘤模型在无菌条件下,取在昆明小鼠体内传代的U14肿瘤细胞,调整密度为2×106个/mL,实体瘤模型于每只小鼠右前肢腋下注射0.2mL,腹水瘤模型于每只小鼠腹腔内注射0.2mL。1.2.3败酱草总皂酸酯小鼠急性毒性试验肿瘤接种后24h,把动物随机分为4组,每组8只。按照A(阴性对照组)灌胃蒸馏水,每只0.2mL;B(阳性对照组)腹腔注射环磷酰胺(CTX),每只0.2mL;C(250mg/kg)、D(1000mg/kg)浓度对建立的小鼠U14宫颈癌模型进行灌胃试验。参照预试验及活性筛选给药量,配制败酱草总皂甙不同浓度的低(250mg/kg)、高(1000mg/kg)试验剂量。所有动物连续15d每天给药1次,观察小鼠生活状态,监测肿瘤体积和体重变化。检测方法如下:荷瘤小鼠抑瘤率:停药次日颈椎脱臼处死小鼠称重后,剖取瘤块称重。肿瘤抑制率/%=(对照组瘤重—试验组瘤重)/对照组瘤重。腹水瘤生命延长率:停药后继续观察小鼠存活天数,记录小鼠死亡时间。生命延长率/%=(给药组平均存活天数—对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数。胸腺(脾)指数:荷瘤小鼠停药次日处死剖取瘤块的同时,取下胸腺、脾脏称重。胸腺(脾)指数/mg/10g=胸腺(脾)重量/去瘤重量×10。小鼠血清抗氧化指标:小鼠眼眶取血,血样4℃静置1h,常温3000r/min离心5min分离血清,-20℃保存备用。测定方法参照试剂盒说明书操作。1.2.4统计方法试验数据以均值±标准差(X¯¯¯±SD(X¯±SD)表示;差异显著性用配对t检验。2结果2.1各组大鼠ctx评分的比较由表1可见,败酱草总皂甙的高、低剂量组对肿瘤均有抑制作用,与阴性对照组相比,以低剂量组(250mg/kg)的抑制效果最明显,抑瘤率达54.6%,且精神状态良好,但与阳性对照组(CTX)相比差异不显著(P>0.05)。2.2ctx阳性对照与草总皂蚤高、低剂量组的存活情况比较停药后各组继续按先前条件饲养,记录各组小鼠死亡时间,计算生命延长率。结果表明,败酱草总皂甙高、低剂量组和CTX阳性对照组的存活天数与阴性对照组相比较差异均极显著(P<0.01)。由表2可见,败酱草总皂甙高低剂量组与CTX阳性对照组相比差异显著(P<0.05),表明败酱草总皂甙能够显著提高腹水瘤小鼠的生命延长率,低剂量组效果更好。2.3败酱草总皂膦对小鼠体外观状态的影响由表3可见,CTX阳性对照组荷瘤小鼠胸腺、脾脏体积明显缩小,个别胸腺分叶不清,呈灰白色,脾脏呈淡红色。而败酱草总皂甙高、低剂量组小鼠的胸腺、脾脏外观色泽质地正常,与阴性对照组无差异。称重后计算表明,败酱草总皂甙高、低剂量组胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组和CTX阳性组相比有所增加,经统计学分析表明,差异极显著(P<0.01)。表明败酱草总皂甙能显著促进免疫器官(胸腺和脾脏)的生长。2.4总皂蚤吾对cat酶活力的影响由表4可见,经检测CAT、SOD、T-AOC酶活力发现,与阴性对照组相比,败酱草总皂甙高、低剂量组可极显著地提高CAT酶活力(P<0.01),高、低剂量组可显著地提高SOD活力(P<0.05),对T-AOC酶活力也是显著提高(P<0.05)。由此揭示败酱草总皂甙可以改善体内低抗氧化状态,推测败酱草可以提高机体抗氧化能力。3败酱草皂茯苓改善免疫器官皂甙作为有抗肿瘤作用的化合物已日益受到研究者的关注,其抗肿瘤机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤细胞信号转导、影响肿瘤细胞周期、抑制肿瘤血管生成及转移等。本研究结果显示,用不同剂量的败酱草皂甙治疗U14宫颈癌荷瘤小鼠后,肿瘤生长均受到不同程度的抑制,其中,以低剂量组效果最佳可高达54.6%,与阳性对照组抑瘤率差异不显著(P>0.05),表明败酱草皂甙对宫颈癌小鼠具有显著的抗肿瘤效果,而且存在一定的剂量关系。肿瘤的发生与发展与人体免疫力密切相关,机体免疫机能的降低有助于肿瘤的形成与发展,而癌症患者经常伴有免疫机能低下和免疫器官萎缩。目前,癌症患者的化学疗法和放射疗法都造成机体免疫功能的抑制,而中医学重视机体免疫的调节,中草药增强癌症患者的免疫功能而达到治疗效果,且毒副作用小。而免疫器官能维持机体的免疫功能,发挥机体自身的抗癌免疫作用。免疫器官主要有胸腺和脾脏。胸腺除了促进T细胞分化和发育成熟,还可促进肥大细胞发育,调节机体的免疫平衡,维持自身的免疫稳定性,在免疫系统中占重要地位,在杀伤肿瘤细胞过程中起关键作用。而脾是成熟T细胞、B细胞定居的场所之一,也是这些细胞受抗原刺激后发生免疫应答的主要部位。T细胞能够分泌多种细胞因子,包括IL-2、IL-6、IFN-γ和IL-10等,其中IFN-γ具有较强的抗肿瘤活性和抗血管生成的作用,IL-2参与抗肿瘤效应。许多研究表明,在肿瘤发生过程中伴随着胸腺组织的萎缩和伤害,肿瘤细胞可能以胸腺组织为靶点,降低T细胞的反应性、诱导T细胞发生凋亡,从而破坏机体抗肿瘤免疫效应。本试验结果表明,败酱草皂甙能促进荷瘤小鼠胸腺生长,阻止胸腺的萎缩,而CTX作为免疫抑制剂显著抑制了胸腺的生长;高剂量试验组对脾脏也有保护作用,而且解剖观察未发现败酱草的毒副作用。这说明了败酱草皂甙能够改善免疫器官,增加机体的抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤生长,对机体不产生毒副作用。机体抗氧化防御体系包括酶促和非酶促两个体系,非酶促体系主要为维生素、氨基酸和蛋白质,如维生素C、维生素E、半胱氨酸、胡萝卜素和硒等;酶促体系含超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。SOD作为生物体内主要的抗氧化酶,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。SOD又是生物体内清除自由基的首要物质,用来对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,以及时修复受损细胞。生物体内,自由基作用于脂质发生过氧化反应,产物为丙二醛(malondialdehyde,MDA),会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有细胞毒性。本研究结果表明,败酱草皂甙能够显著提高荷瘤小鼠血清中SOD的水平,但是SOD的测定只能反映机体抗氧化能力的一个方面,不能全面反映整个机体的抗氧化能力,而T-AOC的测定能够较为全面地反映生物机体的抗氧化能力。试验结果也显示了败酱草皂甙能显著地提高了荷