败酱草多糖抗疲劳和耐缺氧活性研究

败酱草多糖抗疲劳和耐缺氧活性研究

通过口服非全日制营养补剂或药物活性成分的定向补充，可以缓解或缓解运动疲劳的发生，这是解决运动疲劳疲劳的有效途径之一。研究表明,许多植物多糖成分具有改善运动性疲劳的作用,其作用机制大多与提高机体糖储备以及提高机体免疫能力等方面有关,故多糖抗运动性疲劳方面的研究成为近几年运动营养学领域的一个研究热点。败酱草是属于败酱科的一种草本植物,具有清热解毒的作用,在我国各地均有生长,此外败酱草还含有丰富的营养素,在许多地方被作为野生蔬菜食用。近几年的研究表明,败酱草多糖(HerbaPatriniaepolysaccharide,HPP)具有抗呼吸道合胞病毒、抗宫颈癌和抗氧化等药理活性。目前还未检索到有关于HPP的抗疲劳与耐缺氧方面的研究,因此本实验对陕西产败酱草的多糖成分进行提取,建立小鼠负重游泳模型与耐缺氧模型,通过灌胃小鼠HPP来评估其抗疲劳与耐缺氧的效果。1材料和方法1.1试剂和仪器实验动物为健康昆明种雄性小鼠,两月龄,体质量22~26g,购自西安交通大学医学院实验动物饲养中心。败酱草购于西安市吴家坟中药店,粉碎后备用。D-甘露糖(D-mannose,D-Man)、D-核糖(D-ribose,D-Rib)、L-鼠李糖(L-rhamnosemonohydrate,L-Rha)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronicacid,D-GlcUA)、D-半乳糖醛酸(D-galacturonicacid,D-GalUA)、D-葡萄糖(D-glucose,D-Glc)、D-木糖(D-Xylose,D-Xyl)、D-半乳糖(D-galactose,D-Gal)、L-阿拉伯糖(L-arabinose,L-Ara)、D-岩藻糖(D-fucose,D-Fuc)美国Sigma公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one,PMP)、三氟乙酸(trifluoroaceticacid,TFA)北京化学试剂公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯)美国Honeywell公司;透析袋(MW10000)北京鼎国生物技术有限责任公司;其他试剂均为国产分析纯。1.2测试系统752B型分光光度计上海第三分析仪器厂;DD5低温高速离心机湖南凯达科学仪器有限公司;旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;ChristALPHA1-4冷冻干燥机德国Christ公司;紫外-可见分光光度计上海分析仪器厂;ShimadzuLC-2010A高效液相色谱仪、ShimadzuClass-VP6.1色谱工作站日本岛津公司。1.3方法1.3.1酶处理膜法干燥败酱草皮→粉碎→80%的乙醇浸泡30min→滤渣水提(料液比1∶15(m/V)、温度80℃、时间2h、提取次数2次)→过滤→Sevag法脱除游离蛋白质→透析袋对水透析24h→浓缩→终体积分数为80%的乙醇沉淀→无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤→冷冻干燥→HPP1.3.2样品溶液的制备多糖含量测定采用蒽酮-硫酸法;糖醛酸含量测定采用硫酸-咔唑法;蛋白质含量测定采用双缩脲法。紫外光谱采集:称取HPP5mg,配成0.5mg/mL的溶液,以蒸馏水为对照,在紫外光谱仪190~600nm波长区域扫描。单糖组成分析:采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)。取HPP20mg,置于具塞试管中,加水1mL,加热溶解后加入0.2mol/L的TFA1mL,放入烘箱中,110℃水解8h,冷却至室温,加0.2mol/L的NaOH溶液调pH值为7,将水解液用重蒸水稀释至10mL,转移到量瓶中,待测。对照液制备:分别称取适量D-Man、D-Rib、L-Rha、D-GlcUA、D-GalUA、D-Glc、D-Xyl、D-Gal、L-Ara、D-Fuc,用10%甲醇配成0.1mol/L的溶液。各取100μL样品液与对照液,依次加入0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL、0.3mol/LNaOH溶液300μL,70℃水浴60min后冷却至室温,用0.3mol/L盐酸溶液300μL中和,加入氯仿1.0mL萃取,振荡、离心,弃去下层液,重复3次,0.45μm微孔滤膜过滤,取滤液10μL准备上样。采用梯度洗脱方式。流动相A液为纯乙腈;B液由0.45gKH2PO4、0.5mLTFA、100mL乙腈和900mL超纯水组成(pH7.5)。色谱柱:VenusilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);梯度洗脱:0min,94%B液;4min,94%B液;5min,88%B液;30min,88%B液;进样量10μL,流速1.0mL/min,检测波长为250nm,柱温为35℃。1.3.3小鼠体质量变化、血尿素活性、肝功能变化以及肌糖原活性的检测小鼠随机分为3组(每组30只):对照组、HPP低剂量(100mg/(kg·d))组和HPP高剂量(200mg/(kg·d))组。HPP低、高剂量组每天灌胃相应剂量的多糖水溶液,对照组灌胃等量的生理盐水,连续灌胃5周。末次给药30min后,从各组中随机取出10只小鼠进行负重(体质量5%)游泳实验,水温28℃,记录各组小鼠游泳力竭时间(力竭判断的标准:小鼠头部沉入水中5s不能浮出水面)。小鼠力竭后立刻采血取材,测定血乳酸(bloodlacticacid,BLA)、血尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)的浓度和肌酸激酶(creatinekinase,CK)活性。同时在各组剩余小鼠中随机选择10只,不参与力竭游泳,直接麻醉取材,测定肝糖原与肌糖原含量。均使用南京建成生物制剂公司的试剂盒测定。1.3.4小鼠的生长参照文献方法,对各组剩下的10只小鼠进行耐缺氧实验。准备带塞的广口瓶若干,每瓶加入5g的钠石灰,每瓶放入1只小鼠,用凡士林涂抹瓶塞和瓶口,密闭,计时,直至小鼠呼吸停止,记录小鼠的存活时间。1.3.5延长率的计算按照下式计算抗疲劳实验和耐缺氧实验时间的延长率。1.4处理数据数据用SPSS10.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验进行比较,数据用ue0af±s表示。2结果与分析2.1蛋白质及多糖含量检测采用水提醇沉法从1000g败酱草原料中提取出HPP25.4g,得率为2.54%。蒽酮-硫酸法测定多糖含量为58.85%,D-GalUA含量为35.20%,双缩脲法测定蛋白质含量为13.26%;紫外光谱图(图1)显示HPP在280nm波长左右有强吸收峰,表明其确实含有结合蛋白,属于蛋白多糖。HPP的HPLC色谱图(图2)显示:HPP主要含有D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara,其物质的量比依次为0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27。2.2对小鼠耐缺能力的影响如表1所示,与对照组相比,HPP低、高两个剂量组小鼠力竭时间显著延长(P<0.05),延长率分别为23.95%和25.06%。然而HPP低、高剂量组小鼠耐缺氧时间与对照组相比较没有显著性差异,延长率较低(0.78%与2.22%)。结果表明,败酱草多糖对小鼠抗疲劳的作用明显,而对小鼠耐缺氧作用不显著。2.3小鼠肝糖原、肝糖原的变化如表2所示,与对照组相比较,HPP低、高两个剂量组小鼠的力竭后CK活性与BLA浓度显著降低,而HPP高剂量组小鼠的肝糖原含量显著升高,但BUN浓度与肌糖原含量变化不明显。上述结果说明,败酱草多糖能够增加小鼠肝糖原储备,减少运动时的乳酸生成,改善力竭运动造成的小鼠肌组织损伤程度。3败酱草多糖对小鼠运动疲劳的影响本实验采用水提醇沉法对败酱草多糖进行提取,多糖得率为2.54%,含量为58.85%,D-GalUA含量为35.20%。在提取过程中已经对游离蛋白质进行脱除,但紫外光谱结果显示败酱草多糖含有结合蛋白,经双缩脲法测定蛋白质含量为13.26%,因此HPP是一种蛋白多糖。HPLC色谱图结果显示,HPP的单糖组成主要是:D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara(物质的量比依次为0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27)。游泳力竭模型是常用的一种小鼠运动疲劳模型。本实验通过5周的小鼠游泳模型来评价败酱草多糖的抗疲劳作用,测定指标选择与糖原储备、糖代谢相关的指标。肝糖原与肌糖原是耐力运动的主要能量来源,虽然本实验检测到力竭前各组小鼠肌糖原含量无显著差异,但HPP高剂量组小鼠的肝糖原储备明显高于对照组,说明HPP能够提高机体糖原储备,这是其延缓力竭游泳时间的主要原因之一。BLA是反映机体糖无氧代谢的一个重要指标。本实验说明,败酱草多糖能够提高机体糖的有氧代谢能力,降低糖的无氧代谢参与程度,这是败酱草多糖延缓小鼠运动疲劳的另一个原因。目前不少研究证实,植物多糖可以通过改善机体糖代谢系统来达到抗疲劳的作用。BUN反映蛋白质参与代谢的程度,也是检测运动性疲劳的另一个理想指标,机体对运动负荷适应能力越差,不仅糖的无氧代谢参与程度增加,而且蛋白质的分解代谢的程度也会有不同程度的增加,但本实验结果表明,败酱草多糖对于蛋白质的分解代谢影响不明显。血清CK活性的变化是评定骨骼肌微细损伤的一个重要生理指标。过度运动会使机体脂质过氧化程度加大,对肌组织造成一定的损伤。本实验结果表明,败酱草多糖可以降低游泳小鼠血清CK活性,这可能与败酱草多糖的抗氧化