植物组培试验方案 植物离体快繁

模块三岗位提升

项目六组培试验方案设计任务12植物离体快繁技术任务13组培试验设计与分析任务14植物脱毒技术任务15组培工厂化生产【知识点】

掌握离体组织的再生途径

组织培养的基本过程

植物微体快繁方法【技能点】会植物快繁技术

素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务12植物离体快繁技术一、植物离体快速繁殖的概念1、定义又称微体,快繁利用组织培养技术进行的一种营养繁殖方法。在无菌条件下，把离体的植物器官、组织、放在人工控制的环境中，使其分化、繁殖，在短时间内产生大量遗传性一致的完整新植株的技术。2、意义和作用繁殖系数高短期获遗传稳定一致群体获无病毒苗，回复植物原有种性木本植物潜力大，可保持其杂合性推广良种的重要手段工厂化生产无季节限制原始材料少繁殖速度快繁殖周期短3、应用珍惜植物品种和育种原始材料的扩大繁殖繁殖和保存无毒原种材料市场需求大、短期内常规繁殖方法难满足需求的植物经济效益高、难常规营养繁殖植物二、

离体快速繁殖程序（1）无菌培养体系的建立——启动培养（2）增殖培养（3）壮苗生根培养（4）生根苗驯化和移栽（5）再生植株鉴定（1）无菌培养体系的建立从外植体选择、清洗、灭菌、接种和茎芽诱导，到获得茎芽稳定生长和增殖，茎芽繁殖数量可控制的整个时期。目标：获得无惧培养材料，诱导芽的发生。提供合适的试管环境使培养物（茎芽）的生长达到稳定。无菌苗：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料，称为无菌苗或“无菌母株”或“繁殖母株”。外植体的灭菌在一定浓度的灭菌剂药液中浸泡灭菌。药剂灭菌的好坏关系着培养的成功率。根据材料、灭菌剂、经验等决定灭菌剂种类、浓度和处理时间。如：药剂对各种菌类的杀灭效果。如：材料对杀菌剂的忍耐力。把植物材料、灭菌剂及浓度、灭菌时间四者统一考虑。采用多种药剂配合使用。(2)增殖培养促进培养物分化培养，反复继代增殖，达到需要数量。芽增殖途径对增殖结果影响大。芽增殖速度快、慢的关键是培养基。（适宜外源激素种类和浓度配比极其重要）。（细胞分裂素与生长素影响繁殖系数好不定芽质量）试管苗的繁殖速率及计算m为无菌母株苗数，X为每个培养周期增殖的倍数n为全年可增殖的周期数提高繁殖速度的方法：改进培养基：培养基种类、无机及有机成分、糖浓度、琼脂、植物生长调节剂的种类和浓度。（生长素比例大，不定芽生长健壮，细胞分裂素高，繁殖系数高，但组培苗细弱，要将二者比例调整到适宜水平。）改善培养条件：温度、光照（光强、光质、光周期）、湿度、培养器皿、通气状况、培养基的pH值等都与材料的增殖密切相关。培养物保存：当暂时不需要育苗或珍贵资源需保存时，采用低温（1-9℃）进行的中短期保存。芽增殖过程中，值得注意外源激素的累积。长期继代增殖，外源激素的大量积累会造成各种畸形芽（茎）、玻璃化芽,影响不定芽质量。继代培养中需要酌情降低外源激素水平。（3）诱导不定根形成目标：使诱导培养出来的芽丛或不定芽生出不定根，形成完整的小苗（Plantlet）。功能：保证组织培养不定芽生根，提高适应环境能力。壮苗和生根：对不定芽进行壮苗培养，诱导生根。诱导生根的途径试管（瓶）内生根将组织培养茎芽的生根诱导同驯化培养结合在一起，直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中，边诱导生根边驯化培养。试管（瓶）外生根在试管内的无菌培养基上诱导生根，生根苗移栽到有菌环境下驯化培养。诱导根分化技术关键：1）调节外源激素种类和浓度。生长素/细胞分裂素。2）调节基本培养基营养组成。3）调大量元素中硝酸盐和铵盐的含量和比例。4）降低大量元素和微量元素的用量。5）调节渗透压，降低糖浓度。(4)生根苗的炼苗驯化和移栽1）将小苗进行分级苗高和根数是评估移栽苗的重要指标。2）移栽前炼苗移植前要加强自然光照，使小苗逐渐适应外界环境。（在自然光的炼苗室中闭口自然光炼苗2-3周，开口炼苗1-3天。待小苗茎叶绿色加深，根系颜色由白色变为黄褐色即可移栽出瓶。）生根苗的炼苗驯化和移栽：3）湿度锻炼：使小苗逐步适应周围环境的湿度。移栽前开瓶盖进行湿度锻炼。4）基质疏松：珍珠岩、蛭石、西沙，营养土、腐殖土等。5）调控光、温、湿等因子：生长季闭口炼苗期间调控光照强度、防雨水影响。部分遮光条件下移栽后管理，保持合适温度。移苗注意：苗盘消毒：用0.1%的高锰酸钾对苗盘进行浸泡消毒或喷淋消毒。基质消毒：对已用过的需用0.1%高锰酸钾喷淋后用自来水冲洗干净。移栽技术：当根系打到一定长度（小于1cm）时移栽，带琼脂少，伤根轻，移栽时应将小苗基部的培养基冲洗干净，切忌伤根和茎叶。如根长，可剪为2-3cm。移栽后根迅速固着于土壤基质并吸收营养。苗盘移栽：将消毒后的蛭石或珍珠岩放在苗盘内，厚度约4-6cm，用水淋透后，将洗净的组培苗栽植在培养基质内，用水喷淋透后放置在拱棚内保护培养2-3周。保持温度和湿度。营养钵移栽：营养钵与营养土的准备：营养土最好采用腐殖土与细沙（或蛭石）按照3：1的比例混合过筛后备用。将组培苗从苗盘提出，栽植在营养钵中，浇一次透水后集中摆放在不易积水的地方，遮荫、保温、保湿。移栽后的管理：遮荫和保湿。移栽初期防止阳光直射，逐渐增加日照时间和强度，提高自养能力，提高成活率。塑料膜保湿和喷雾保湿结合。（5）再生植株的鉴定意义培养时取材部位不同、器官发生途径不同、培养基中各种物质，特别是植物外源激素，对植物细胞构成化学诱变环境。那些在遗传上可塑性强的种和那些易于器官发生型的植物种的再生植株群体，可能会发生变异，故需要进行鉴定。方法1、形态鉴定：在田间对再生株的植物学性状进行鉴定，发现变异株再作细胞学鉴定。2、细胞学鉴定：对再生株群体抽样检查根尖染色体数目以及减数分裂期的染色体行为。3、分子鉴定：抽取再生株中的个体幼嫩叶片，提取DNA，通过分子标记手段，检查标记类型是否与原有品种（系）保持一致。离体快速繁殖程序例:千头椿离体快速繁殖程序及技术要求初始外植体（带芽茎段或茎尖）无菌培养物稳定繁殖体愈伤组织丛生芽嫩梢有效嫩茎试管内生根试管外生根温室苗鉴定大田苗栽植流水冲洗1-4h，70%酒精30s，0.2%HgCl2消毒2-8min，无菌水冲洗3-5次，接种到初代培养基，培养10-20天接种到继代培养，培养30-35天接种到生根培养基，培养10-30天100mg/kgIBA浸30g定植移栽三、组培分化过程的类型不同植物不同外植体类型不同培养基器官再生途径差异大1.无菌短枝和芽丛型选取顶芽或腋芽，促进其生长和诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。茎尖会分化出叶片和侧芽，侧芽又再次分化为叶片和侧芽茎尖会诱发腋芽萌发，形成芽丛芽丛被分割成单芽或小芽丛，继代增殖产生大量试管苗顶端优势效应应抑制腋芽生长。将腋芽从植物上分离，给相应培养条件，形成大量不定芽。特点：繁殖率高、繁殖数量大、保持遗传稳定性。例如：草莓，半个月内可增加10倍，1年内1棵草莓可产生数以百万计的试管苗。3）器官发生型从器官诱导愈伤组织，经细胞再分化生成植株的方式。例：禾本科：甘蔗、水稻、小麦、大兰茎草、印度草，百合、浙贝母、小苍兰、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕桐等。特点：繁殖速度快，遗传性不稳定。4）胚状体发生型由植物器官、组织和细胞培养直接发生类胚结构，以胚状体成苗的方式。胚状体：植物组织培养过程中，起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成具有双极性的胚状结构，又称体细胞胚直接体胚发生途径：从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚。（如百合与花序和百合鳞片）间接体胚发生途径：外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚。（如萝卜、芹菜、苜蓿、一品红、满天星、康乃馨）。特点：遗传性一致，数量大。如胡萝卜1L培养基有10万个以上的胚状体。5）原球茎发生型是兰属特有的器官发生方式，促进兰花栽培变革，建立兰花工业。将兰花茎尖培养于MS培养基，附加适量的椰子汁、NAA和6-BA，经26℃暗培养，分化出乳白色圆球茎，切成数块继代培养到相同的液体培养基上震荡培养，形成大量圆球茎。将丛生的圆球茎转接于固体培养基上，大量增殖，并抽叶生根，形成完整兰花苗。不同器官发生方式对比发生方式优点缺点腋芽型