植物组培苗培养与管理 组培苗培养与管理

项目五组培苗培养与管理任务10组培苗的培养任务11组培苗驯化与移栽【知识点】组培易发问题的原因与调控措施组培苗培养条件，组培苗的特点，组培苗驯化方法【技能点】能解决组培易发问题，培养健壮组培苗会进行组培苗移栽养护素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务10组培苗的培养一、组培苗培养1、培养程序1）初代培养指在组培过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段，即无菌接种完成后，外植体在适宜的光、温、气等条件下被诱导成无菌短枝（或称茎梢）、不定芽（丛生芽）、胚状体或原球茎的过程。也称为诱导培养。

由于外植体来源复杂，又携带较多的杂菌，初代培养一般是比较困难的，是植物组培成功的关键技术之一。2）继代培养将初代培养诱导产生的愈伤组织、芽、苗、胚状体或原球茎等重新分割，接种到新配制的培养基上，进一步增殖扩繁的培养过程称为继代培养，也称增殖培养。

通过初代培养多获得的不定芽、无菌短枝、胚状体或原球茎等无菌材料被称为中间繁殖体。中间繁殖体可以按几何系数扩繁。例如：2株苗为基础，每棵苗的繁殖系数为3（即一株苗剪成3段接种，培养一段时间后每段又形成3株苗），那么经过10代繁殖，将生成多少株苗？2×310=1180963）壮苗与生根壮苗培养生根培养：NAA和IBA是最常用于诱导生根的生长素，使用浓度一般为0.1-10.0mg/L。2、组培苗培养条件1）温度：培养室内的温度通常是控制在25±2℃。2）光照：植物所需的光照强度为1000-5000lx，培养室每日光照10-16h。3）湿度：容器内的湿度常可保持在100%，培养室的相对湿度一般应保持在70%--80%之间。4）通气：在固体培养中，不要把培养物全部埋入培养基内，以避免氧气不足。

培养室要适当通风换气，改善室内的通气状况，每次通风后要进行一次消毒，避免引起培养物污染。1.试管苗培养条件。2.培养程序。小结啊？？二、组培污染的原因及防治组培常见问题1、培养基污染来源与防治（1）培养基污染可能的来源培养容器操作器械接种室的环境操作者本人培养室的环境外植体培养基本身污染的病原分为细菌和真菌两大类（2）细菌污染原因分析材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员的不慎使用了未经充分灭菌的工具（镊子、培养皿等）手接触材料或器皿边缘，使微生物落入材料或器皿防治：1、接种前，洗手，用70%酒精棉球擦拭双手；戴口罩，不说话，防止呼吸时呼出的细菌所引起；每接一瓶材料后用酒精擦手指。防治：2、提高外植体灭菌技术，选取带菌少的材料，微生物少的季节和时间。3、每个培养周期不宜过长。4、培养瓶容器的封口类型。防治：5、接种用的工具每接一瓶至少要灼烧灭菌一次。6、凡是污染材料，均要高压蒸汽灭菌，或用70%酒精杀菌，降低污染源。（2）真菌污染原因分析接种室的空气本身不洁净、灰尘很多超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大操作不慎等原因引起防治：1、无菌室内安装空气循环过滤装置，通过紫外线照射灭菌。2、超净工作台提前开机20min以达到空气的充分过滤灭菌。3、接种，用70%酒精棉球擦拭双手，戴口罩，不聊天；每接一瓶后用酒精擦手指。4、接种时要严格操作，接种工具要烧红，不碰触任何物品，打开瓶盖时动作要轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角等。5、培养瓶容器的封口类型。6、每个培养周期不宜过长。7、凡是污染材料先高原蒸汽灭菌，或用70%酒精杀菌，降低污染源。8、培养室安装净化设备，并勤开紫外灯灭菌，以及酒精喷雾和冰醋酸熏蒸灭菌。

提问针对操作流程：外植体取材——预处理——消毒——接种——组培苗培养与管理，分析每个步骤引起的污染源2、培养常见问题及对策1）污染所谓污染是指在组织培养过程中，有细菌、真菌等微生物的侵染，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象。（1）污染识别若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染。若是外植体带菌，菌类从材料的培养基以上部位长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。（2）来源材料表面消毒不彻底，植物材料带入培养过程。植物内生菌随材料带入培养过程。无菌操作过程中外界环境进入培养容器造成。（3）种类细菌性污染：培养基某一位置或培养材料周围出现黏液状或浑浊的水渍状痕，有时呈现发酵状泡沫。接种后1-2天可见。真菌性污染：培养基污染部位发霉，颜色黝黑、白、黄等。接种后3-5天或更长时间出现。（4）污染的防止选择合适的植物材料：幼嫩材料、温室材料、清洁材料、草本材料、中午阳光最强时的材料带菌少。严格灭菌：对难灭菌材料采用多次灭菌法，对材料内部的细菌，可在培养基中添加抗生素来解决。污染的防止合理安排繁殖程序：将获得的无菌培养物一部分保存起来，分批繁殖和复检后再提供给大规模生产。操作规范：培养室要求清洁、密闭、接种室要经常用紫外线照射、冰乙酸熏蒸、70%酒精喷雾杀菌等。2）褐变褐变（又称褐化）是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐，甚至死亡的现象。（1）成因切割外植体时，体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。（2）影响褐变的因素基因型：褐变和品种有关，在多酚氧化酶活性上的差异，对不同的品种分别进行处理。生理状态：褐变程度的轻重常与取样外植体组织的生理状态有关；处于幼龄期的植物材料或幼嫩的组织褐变程度不明显，而从成年的植株或老熟的组织采收的外植体，含醌类物质较多，容易褐变。培养基成分：无机盐浓度过高，会使某些观赏植物的褐变程度增加；细胞分裂素的水平过高会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。外植体大小：材料太小，在培养过程中容易褐变。外植体组织的受伤程度：在取材料时，应尽量减少伤口面积，创伤面要尽量平整。影响褐变的因素培养材料的继代时间：培养过程中，如果推迟继代时间，会导致材料的褐变，最终材料全部死亡。灭菌的化学药品：杨树叶片作外植体，用70%乙醇时间处理过长，容易褐变。温度和光照：光照国强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，加速培养物的褐变程度。(3)克服外植体褐变的方法适合外植体和培养条件：选择生长处于旺盛的外植体，可使褐变现象明显减轻。无机盐成分，植物生长物质水平，适宜温度均可以减轻材料的褐变现象。连续转移（继代培养）：对容易褐变的材料可连续继代培养，减轻醌类物质对外植体的毒害。加入抗氧化剂：使用半胱氨酸，抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻褐变现象。另外，使用0.1-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。3）试管苗玻璃化当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化（也称为超水化现象）。发生玻璃化的试管苗称为玻璃化苗。（1）特点形态解剖学特点：整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。生理生化特点：玻璃化苗体内含水量与可溶性糖含量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。(2)玻璃苗的危害呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。玻璃庙生长缓慢、繁殖系数下降，如果再在相同的培养基上和相同的培养条件下进行继代培养后死亡。玻璃苗生根困难。（3）控制和克服玻璃化的措施使用固体培养基：增加琼脂浓度，降低培养基水势，造成细胞吸水阻遏；提高琼脂纯度，也可降低玻璃化。适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。提高光照强度，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。使用透气性好的封口材料，改善氧气的供应状况，降低培养容器内部环境的相机湿度。（3）控制和克服玻璃化的措施培养基中加入间苯三酚或根皮苷、青霉素钾、活性炭、聚乙烯醇（PVA）均可有效抑制玻璃苗的发生。青霉素G钾（2-6mg/L）能有效防治菊