板蓝根颗粒的微生物限度检查（中药制剂检测课件）

板蓝根颗粒的微生物限度检查【实训目的】1.熟练掌握中药制剂中细菌、霉菌和酵母菌总数的测定方法。2.学会中药制剂中控制菌的检查方法。【实训内容】（一）实训用品1.仪器：玻璃器皿及用具、超净工作台、恒温培养箱（30~35℃）、生化培养箱（23~28℃）、电子天平、菌落计数器、恒温水浴锅、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌平皿（直径90mm）、无菌称量纸、无菌移液管、洗耳球、无菌药匙等。2.培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基。3.试液、稀释剂和试剂：0.9%无菌氯化钠、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、靛基质试液。4.材料：板蓝根颗粒。（二）实训方法1.板蓝根颗粒为不含药材原粉的口服制剂。按药典规定，每lg供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，并不得检出大肠埃希菌。2.采用平板菌落计数法，测定每克板蓝根颗粒中的细菌总数和霉菌总数，以判定供试品是否符合药品标准规定；将板蓝根供试液用BL培养基增菌培养后接种到MUG培养基培养，必要时加入靛基质试液数滴，观察结果，判断是否有大肠埃希菌。（三）实训步骤1.细菌、霉菌和酵母菌总数的测定（1）供试液制备：以无菌操作称取板蓝根颗粒10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，充分振摇，使其完全溶解成1：10均匀稀释液。取3~4支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，立即塞上试管塞。另取1支lml灭菌吸管吸1：10均匀供试液lml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀即1：102供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀释级。（2）供试液注皿在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释10级供试液各lml至每个灭菌平皿中，每一稀释级培养基至少注2~3个平皿，注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。一般取适宜的连续23个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。（3）阴性对照：待各级稀释液注皿完毕后，用1支lml吸管吸取稀释剂（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）各lml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照。（4）倾注培养基：将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基溶化，冷至约45℃时，倾注15~20ml相应的培养基至上述各个平皿，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液与培养基混匀，置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。（5）培养：一般细菌计数平板倒置于30~35℃培养箱中培养3天；霉菌、酵母菌计数板倒置于23~28℃培养箱中培养5天。（6）菌落计数：一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。（7）菌数报告：宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告lg供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2.大肠埃希菌的检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10~100cfu，方法同供试品的控制菌检。阳性对照试验应检出相应的控制菌。取稀释剂10ml按相应控制菌检法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。（1）取均匀供试液10ml（相当于供试品lg），直接或处理后接种至100ml的乳糖胆盐培养基中，培养18~24小时，必要时可延长至48小时。（2）取上述培养物0.2ml，接种至含5ml4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基的试内，培养，于5小时、24小时在366mn紫外光灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂：本色，为基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。（3）如MUG阳性、靛基质阳性，判定供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、基质阴性，判定供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的板上，培养18~24小时。观察平板上无菌落生长、或分辨生长的菌落的形态特征，必要时可对可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，判定供试品是否检出大肠埃希菌。【实训提示】1.所有器具必须经严格灭菌，使用过程中不得与外界未消毒物品接触，一旦接触应立即换用。切忌长时间暴露于空气中。2.进行细菌检验的整个过程均须在无菌室、超净工作台或接种罩内进行操作（特殊情况例外）。3.灭菌的试管及玻璃瓶每次打开和关闭时，口部均应在火焰上通过1~2次，以杀灭可能从空气中落入的杂菌。接种环或接种针每次使用前后，均应在火焰上彻底烧灼灭菌，金属棒或玻璃棒亦须转动着通过火焰三次。4.皮肤表面及口腔内常存在有大量杂菌，故在检验时切忌用手接触标本及已灭菌的器材内部，也勿用口吸、吹。吸管上端应塞以棉花，以防其他杂菌混入培养物中。5.采用脱水培养基，应按说明配制，应对灭菌后的培养基pH进行校验；若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量；试剂：规格应为化学纯以上；配制的培养基不应有沉淀；如有沉淀，应于溶化后趁热滤过，灭菌后使用；培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出；灭菌后的培养基应保存在20~25℃，防止被污染，可在三周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏；已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用；培养基不能反复加热溶化。6.供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。否则，可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。供试液稀释及注皿时应振摇后取均的供试液，以免造成实验误差。7.细菌菌落的形态及色泽因细菌种类的不同而异，应注意观察鉴别。1.颗粒剂的微生物限度标准是什么？2.大肠埃希菌菌落形态特征是什么？【实训检测】【实训报告】中药制剂的微生物限度检实训记录供试品名称

供试品来源供试品编号检验稀释度1：101：1001：1000细菌菌落数

霉菌菌落数

实训结果细菌总数个/S：霉菌总数个/K；大肠埃希菌检验结论本品按《中国药典》2015年版微生物限度检查法检验，结果符合或不符合规定记录检查结果，并将其与药品标准相比较，判断供试品是否符合规定。【实训测试】序号考核内容技能要求分值实得分1试验前的准备正确按要求对无菌室进行灭菌5

按无菌操作要求将所需已灭菌或消毒的用品移至无菌操作室5

按要求正确穿戴无菌服，进入无菌操作室5

正确对供试品外包装进行消毒后启封，检查并作出初步判定5

2供试液制备正确进行供试液的配制5

正确准备试剂5

正确制备1：10的供试液8