CD4 T淋巴细胞绝对计数检测

粒细胞分类淋巴细胞为CD45强阳性，颗粒度较低的一群细胞1淋巴细胞分群B淋巴细胞CD19+T淋巴细胞CD3+T辅助/诱导细胞CD3+CD4+淋巴细胞（CD45+）NK细胞CD3-CD16+56+T抑制/细胞毒性细胞CD3+CD8+2淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽的功能。CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。3HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用感染细胞-未感染细胞形成合胞体程序性细胞死亡自身免疫机制特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。

4HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降T细胞亚群比例倒置，CD4+细胞功能受损51、了解机体的免疫状态以进行疾病分期；2、预测疾病进展，判断并发症的出现；3、确定开始HAART的指征；4、药物疗效的评价指标；大多数病毒完全抑制者，CD4计数平均每年增加100个/mm3。CD4+T淋巴细胞数量检测的意义62-6weeksmeanof10yearsAsymptomaticphaseFlu-likeDiseaseSymptom-aticphaseAIDS10005002000CD4Tcells/mlInfectionSeroconversionDeathCD4TcelldepletionHAART7CD4+T细胞临床阶段A无症状或急性HIV感染或持续性全身淋巴结肿大B出现症状，不是A或CC艾滋病指针性症状>500/ul（≥29%）A1B1C1200-499/ul（14-28%）A2B2C2<200/ul（<14%）A3B3C3

成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）

CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。8

并发症与CD4细胞数的关系（ArchInternMed,1995,155）

CD4细胞数感染性并发症非感染性并发症

500/mm3急性逆转录病毒综合征持续性全身淋病腺病

念珠菌性阴道炎吉兰-巴雷综合征肌病

无菌性脑膜炎

200~500/mm3肺炎球菌和其它细菌性肺炎子宫颈上皮肉瘤宫颈癌

肺结核带状疱疹鹅口疮特异性B细胞淋巴瘤

隐孢子虫病贫血多发性单神经炎

卡波济肉瘤口腔毛壮白斑病特发性血小板减少性紫癜

何奇金淋巴瘤淋巴细胞间质肺炎

200/mm3卡氏肺孢子虫肺炎消瘦周围神经紊乱HIV相关痴呆

组织孢浆菌病球孢子菌病心肌病空泡性脊髓炎

粟粒性/肺外结核进行性多发性神经根病

多发性多灶性脑白质病何奇金淋巴瘤

100/mm3弥漫性单纯疱疹弓形体病

隐球菌病慢性阴孢子虫病

微孢子虫病念珠菌食道炎

50/mm3弥漫性巨细胞病毒感染中枢神经淋巴瘤

鸟分枝杆菌综合征

9确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）

病程CD4+T淋巴细胞病毒载量建议症状期任何值任何值治疗无症状期CD4+T细胞<200/mm3任何值治疗无症状期CD4+T细胞>200/mm3，但<350/mm3>30000（bDNA）或>55000(RT-PCR)建议治疗。另外还要根据CD4+T细胞下降率和患者的愿望无症状期CD4+T细胞>350/mm3<30000（bDNA）或<55000(RT-PCR)建议延迟治疗观察。未经治疗者3年发展至AIDS<15%.10虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断标准。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:

-丙球蛋白缺乏症

-胸腺发育不全(DiGeorge氏综合症)

-严重的联合免疫缺陷提示11生理状况和疾病对CD4+细胞

计数的影响▰昼间变化：最低值是中午12：00左右，最高值是晚上8：30左右，还有季节变化▰急性感染和免疫接种：CD4+细胞计数减少▰药物：肾上腺皮质激素使CD4+细胞计数↓▰性别、成人的年龄、妊娠、心理压力等对CD4+细胞计数影响很小▰避免在并发感染治疗后或免疫接种后4周内检测12结果解释▰至少连续2次CD4+细胞检测均显著变化时，才能说明CD4+确实发生了变化。▰

CD4+细胞绝对数改变30%以上，或CD4+细胞百分比改变>3个百分点才有意义。▰例如：CD4+细胞数为500/μl、CD4+细胞百分比为20%的病人，连续两次CD4+细胞计数下降，绝对数减少至340/μl，百分比降低为16%，说明CD4+细胞确实发生了显著性变化13仪器的选择1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞仪（FACSCalibur、Coulter)2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪（FACSCount、Guava)3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如Dynabeads）4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200/ul。14流式细胞仪工作原理15流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。16流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞17流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量工作原理18流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统 激光光源 光收集系统电子系统 光电转换 数据处理系统19InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪流动室示意图20细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。21FACSCaliburTM系统选配BDBTritest/TruCOUNTTM

试管22样本的采集、处理

EDTA（血液）抗凝血采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。23样本的运送在室温下（18

23℃）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。不可检测溶血或结冰的样品。不可检测凝血的样品。如果样品的采集时间已超出48h，不可检测。24试剂BD公司CD3/4/8联合抗体BD公司TruCount管25操作步骤20ul抗体50ul全血混匀，避光静置15分钟混匀，避光15分钟450µLFACS溶血液(1x)26应用软件MultiSETFACS系列流式细胞分析仪使用的全自动软件外周血直接多色荧光分析自动获取标本，分析数据获得关于外周血中淋巴细胞各类亚型细胞的信息绝对计数，直接给出结果。TruCOUNT27检测外周血，计算淋巴细胞及待测亚型的相对含量和绝对含量使用直接荧光标记抗体，一步完成三色或四色荧光标记免洗试剂设计，操作简便，减少细胞丢失质量控制保证28CD4绝对计数结果样本编号名称检测结果散点图实验室报告29正常参考值测定结果临床报告30MultiSET注意事项使用精密加样器，准确加取50

l标本，建议使用反向加样法TruCOUNT管批号不同，beads含量不同，更换批号时注意更改MultiSET中的LotId和beadscount。不同批号的TruCOUNT管不能混用TruCOUNT管应在2-25

C密封干燥保存，取出后应在1小时内使用请配套使用FACS溶血液应使用新鲜标本进行试验31内置微处理器实现数据自动分析自动打印质控与病人的检测结果简单易用的系统控制面板配套的样本制备工作台简捷的样本制备方法，避免细胞损失BDBFACSCountTM系统32仪器特点样本稳定性制备后室温(20—250C)储存48小时全血稳定性采集后室温(20—250C)储存48小时范围CD4+:50-2000个细胞/uLCD8+:100-2000个细胞/uLCD3+:100-3500个细胞/uL33CD4+T细胞检测的质量控制质量控制是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施。34实验室质量保证工