隐球菌动物模型研究进展

隐球菌动物模型研究进展

动物模型在隐菌的研究中起着重要作用。它不仅是对留学生感染隐菌后病理生理、遗传免疫等反应的研究，也是对留学生感染后隐菌的生物化学、细胞学和生物学变化的重要手段。隐球菌可以从许多动物分离到,如鸟类、禽类、啮齿类、灵长类等,其中部分如鸽类等并不处于疾病状态。从一些昆虫中也可分离到隐球菌,如蟑螂、木虱和螨虫等。但由于不同动物的遗传稳定性、实验重复性不同,并不是所有能够引起感染的动物均可作为动物模型。1选择适宜的实验动物按遗传控制方法的不同,根据基因纯合的程度,一般可将实验动物分为近交系、突变系、封闭群和杂交群4类。近交系在遗传上具有高度纯合性和稳定性的纯品系动物。封闭群繁殖率高、具有杂合的特性,适于大量繁殖,因此非常适用于生物制品、制药行业中各种药品的安全性和效价等对实验动物需求量大的研究。研究目的不同,需要选择不同类型的实验动物。如研究隐球菌感染后引起宿主遗传学特性或免疫学特性上的反应,一般需要选择重复性强的近交系动物;若要评价新药对隐球菌的作用,则需选择可以大量繁殖的封闭群动物;若要研究宿主某特定基因对隐球菌致病的作用,则需选择某特定基因突变的突变系动物。隐球菌被归为生物动物安全Ⅱ级病原菌,因此推荐在Ⅱ级生物安全柜中或具有相应安全级别的实验室中进行隐球菌动物实验。尽管环境中隐球菌播散于人类而引起致病的确切机制还不是十分清楚,然而研究人员仍需注意处理饲养动物的废料以及饲养环境等的消毒。而有些动物模型尤其是肺部感染模型,如小鼠经气管内吸入构建的模型,可能使病原菌播散到空气中而引起研究人员感染。因此免疫力低下的人员应避免接触。偶有研究人员被污染的注射器刺伤而引起局部皮肤感染的报道,都应引起实验操作人员的注意。出现这种情时应及时预防性使用抗真菌药物以避免局部感染或隐球菌扩散感染。2隐球形的致病性机制从19世纪后期开始,研究人员陆陆续续采用了一系列动物种群来研究隐球菌的致病机制。目前采用最多的是豚鼠、小鼠、大鼠和兔。这四种动物用于隐球菌感染模型构建的优缺点见表1。2.1动物感染模型的构建豚鼠(Guineapig,Caviaporcellus),又名豚猪、天竺鼠、荷兰猪,是最早被用于研究隐球菌感染的动物模型,同时它也被广泛应用于其他侵袭性真菌感染动物模型的研究,如接合菌病、曲霉病、念珠菌病等。豚鼠的隐球菌感染实验动物模型主要通过静脉注射、腹腔注射和气管吸入病原菌的方法构建。静脉注射构建豚鼠系统性隐球菌感染一般需采用的病原菌为103～105数量级。有人采用新生隐球菌B42419株来构建隐球菌豚鼠感染模型,注射菌量为200CFU/g体重,成功地使豚鼠的大脑、淋巴结、肌肉及皮肤产生感染表现。采用腹腔注射的方法来构建隐球菌豚鼠感染模型需病原菌量达到105～107。腹腔注射高浓度的新生隐球菌(107CFU)可使豚鼠发生肺部和脑部感染,并有不同程度的脾脏、肝脏和肾脏的感染。而气管吸入的方法构建豚鼠隐球菌感染模型所需菌量不低于103,该方法比较常用,但也存在着麻醉深度的问题。麻醉太浅可能导致病原菌“吃”入消化系统而“吸入”相对较少,而麻醉太深则可导致实验动物无法“吸入”病原菌。不过,总体来说,用气管吸入法来构建隐球菌动物感染模型相对比较方便。有研究显示相同的新生隐球菌菌株通过呼吸道接种,豚鼠比大鼠对感染更具抵抗力。但Bulmer等用(1.5～17)×107CFU的无荚膜新生隐球菌经气管吸入的方法构建模型,6h后杀死动物,仍可在肺部培养到新生隐球菌,这说明豚鼠的肺泡巨噬细胞并不能有效杀灭新生隐球菌。与人类一样,雌性豚鼠比雄性豚鼠对隐球菌更具抵抗力,所以在构建动物模型时要注意不同性别的豚鼠给菌量需做一定的调整。豚鼠作为实验动物模型的优点是温顺,便于各种实验操作。而缺点是豚鼠的近交品系少,不利于分析宿主对隐球菌的反应;可用于豚鼠相应研究的免疫学试剂少,不利于分析各种免疫因素对隐球菌的影响。2.2免疫抑制预处理兔,即家兔(domesticrabbit,Oryctolaguscuniculus),在早期研究中,因为兔的睾丸部位温度较低,因而可接种产生隐球菌病,但由于该模型不能反应自然感染的传播途径,所以临床意义很小。兔因其体型和脑容量相对较大,因此常用于中枢神经系统隐球菌感染动物模型的研究。它相对其他常用动物模型的一个优点是可以在实验中多次收集脑脊液的菌体,有利于连续观察和研究病原菌的反应。兔的脑脊液总共约8mL,每次可采集1mL而不会影响兔的正常生存。兔中枢神经系统隐球菌感染动物模型的构建可通过直接脑池注射的方法来实现。在构建兔中枢神经系统隐球菌感染前需采用糖皮质类固醇激素进行免疫抑制预处理。在临床上,兔隐球菌感染模型的致病状态与糖皮质类固醇的用量明显相关,因此在构建模型时所采用的糖皮质激素的用量需进行一定的摸索。采用这种方法构建动物模型有一个重要的问题就是动物麻醉。由于兔对麻醉剂非常敏感,因此麻醉剂的用量需个体化。兔处于麻醉状态时其呼吸道容易收缩而导致窒息,在实验中应予以重视。一般可采用氯胺酮或氯胺酮、赛拉嗪和乙酰丙嗪的混合物或异氟醚气管吸入的方法。麻醉后用细针将制备好的病原菌液注射入脑池。一般需要大剂量接种(>106CFU)才能致病。由于不同隐球菌菌株的毒力也不同,因此接种的菌量需进行相应调整。兔也用于眼部隐球菌感染模型和皮肤感染模型的研究,但相对较少。直接给兔皮内接种隐球菌能产生皮肤损害,皮损大小与接种量的多少相关,且近30%的动物模型中,损伤从皮肤向其他部位播散。兔隐球菌动物感染模型的优点是需要进行免疫抑制处理,这与人类感染隐球菌的条件相类似;兔的体重较大使某些体液如脑脊液的重复取样成为可能,这不仅有利于研究致病状态下的病原菌各种生物学、遗传学的特征,也有利于药物治疗的研究。例如兔模型在治疗隐球菌性脑膜炎时应用两性霉素B比现今使用的唑类药物能产生更为快速的脑脊液菌体转阴。尽管与人一样,该模型脑脊液中两性霉素B和伊曲康唑含量极低,但这两种药物仍旧是兔和人类隐球菌性脑膜炎治疗的有效药物。该模型也有效地用来在动力学上研究中枢神经系统的宿主反应,包括体液免疫、趋化因子和脑脊液细胞类型及它们的活化等。兔隐球菌感染模型的缺点包括动物饲养费用高、可使用的近交品系极少而不利于研究隐球菌感染后动物的遗传学特征、缺乏相应的免疫试剂使宿主对病原菌的免疫反应研究困难重重、在构建模型时需要免疫抑制使操作更为复杂、感染的非自然途径(如采用脑池内接种)等。2.3在免疫抑制和感染方面的应用及发展大鼠(rat,Rattusnorvegicus),别名褐鼠、棕鼠、沟鼠、大白鼠。大鼠的正常体温为37.8～38.7℃。大鼠的近交品系有100多种,常用的主要有ACI系、F344系、M520系、SHR系、COP系和GH系等。常用的大鼠封闭群主要有Wistar白化大鼠、Sprague-Dawley白化大鼠、Long-Erans大鼠和Brown-Norway大鼠等。还有裸大鼠,其基因符号为rnu,纯合裸大鼠(rnu/rnu)具有与裸小鼠基本相似的特征,无胸腺,缺乏功能性T淋巴细胞,B细胞功能基本正常,NK细胞活力增强,抵抗力差,易患呼吸道疾病,繁殖方法与裸小鼠相同,但躯干部仍有稀少被毛而并非像小鼠那样完全无毛,头部及四肢毛发更多。因其体型较大,有利于常规的血液学和血清生物化学分析。大鼠模型已在多种免疫和病理研究中得以使用,以阐明隐球菌病的某些特征。大鼠可以很好地用来构建肺部隐球菌慢性感染和潜伏感染模型,这种感染动物模型可经糖皮质类固醇激素处理后激发。经气管接种隐球菌感染大鼠动物模型可以复制人类隐球菌肺炎的许多特征,如细胞趋化、肉芽肿反应、微小的肺外播散以及血清中低滴度的荚膜多糖抗原。事实上,Goldman等对大鼠模型研究结果显示在血清中检测到隐球菌多糖抗原时新生隐球菌可能已经向肺外播散。与大部分近交系小鼠相比,免疫抑制的大鼠经气管吸入法建立隐球菌肺部感染模型存在更大的不确定性,说明大鼠比小鼠对隐球菌更具内在的抵抗力。研究显示这种抵抗力的差异可能与肺泡巨噬细胞抗隐球菌的能力有关。大鼠已被进一步改造为研究肺部隐球菌病致病机理的一个模型。新生隐球菌可能是大鼠的一种自然致病菌,可引起自然界大鼠的肺部感染。由于大鼠比小鼠体积大,因此气管内接种能较易成功而不需要特定的外科技术支持,且不会对组织或肺结构产生可能的损害。在大鼠模型中,早期虽可产生肺外播散,但通常情况下感染局限在肺部。因而在不需要特异性免疫抑制的情况下即可成功构建亚急性免疫反应和感染的研究模型。大鼠体型较大的另一个优势是其也可以通过脑池注射的方法直接构建隐球菌脑膜炎大鼠模型,但相对兔隐球菌脑膜炎模型而言,其操作更为精细且死亡率高。且其由于体型较兔小而使其在脑脊的采集方面的缺点显而易见。与小鼠相比,大鼠的较大体型可以较易通过经气管内吸入感染成功构建模型而无需外科手术支持,更能为研究者提供进行部位特异性和动力学研究的技术可能,如进行支气管灌洗术和脑脊液采样等。大鼠可采用近交系动物也比较多,这为研究隐球菌感染后宿主的各种遗传学、免疫学反应提供可能。大鼠的基因组相对兔而言较为简单,使其为研究隐球菌感染后遗传学反应提供了更为光明的前景。其缺点是饲养费用较小鼠昂贵,可用免疫学试剂较小鼠少,使其在研究隐球菌感染后宿主免疫反应特征方面更为困难。2.4宿主的免疫反应实验小鼠(mouse,Musmuscculus),我国目前使用最广泛的是昆明小鼠,常用的小鼠近交品系主要有:A系、AKR系、BALB/c系、CBA系、C3H系、C57BL/6系、DBA/1系、DBA/2系、NZB系、SJL/N系、AFB系、C3HA系。突变系中目前在真菌(隐球菌)研究最重要的是通过基因敲除的方法所产生的不同基因敲除小鼠。目前敲除的主要目的基因包括细胞因子、各种酶、细胞表面受体、淋巴细胞亚型等。基因敲除小鼠对研究宿主在隐球菌感染后的反应具有非常重要的价值。如Toll-likereceptors(TLRs)基因敲除小鼠(TLR2-/-)明显易产生肺部或系统性隐球菌感染;IFN-γ基因敲除小鼠易产生血清型A的隐球菌系统性感染。另外应用于实验研究的基因敲除小鼠有IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-23等。各种近交品系的小鼠对隐球菌感染的易感性存在不同,这些差异有助于用来研究探讨致病机理。例如,CBA/J和BALB/c小鼠比C57BL/6小鼠对肺感染更具抵抗力。这些小鼠种系间的差异可用来寻找细胞因子网络中更为细小的缺陷和控制隐球菌病的特异性效应器功能。小鼠种系间易感性的差异甚至能将重要的免疫因子定位到宿主染色体的特异性区域。CB-17小鼠比BALB/c小鼠具有更强的从肺中清除新生隐球菌的能力。缺失CD4+T淋巴细胞的小鼠肺组织对新生隐球菌炎症反应弱,而CD8+T淋巴细胞缺失的小鼠肺清除新生隐球菌能力下降,丧失迟发型超敏反应且不识别抗原或在体外试验无淋巴细胞增殖。这些研究结果表明对隐球菌感染的主要抵抗力是复杂的和多基因控制的。这些研究显示宿主(小鼠)对隐球菌保护性免疫反应的广度。这种免疫反应是多因素的,包括细胞和体液免疫,两者均受到基因控制。近交系小鼠是目前研究隐球菌感染最普遍应用的实验动物。不同隐球菌菌株在同一近交系中具有不同的致病力。而在综合的毒性研究中,每组实验中宿主反应相对一致这是非常有利的,而近交系小鼠模型通常能做到这一点。同时通过遗传或免疫方法可以改变小鼠的免疫能力,该特征在探讨特异性宿主-寄生菌间相互作用方面相当有帮助。近交系小鼠很容易通过气管吸入法、鼻饲法、静脉注射法和腹腔注射法等构建隐球菌感染动物模型且不需要进行免疫抑制预处理。目前发现了一系列小鼠自发性的免疫系统的遗传缺陷使其对隐球菌感染极为敏感,这些基因主要有Hc基因(其突变使小鼠C5补体缺失)、IgH复合物(功能尚不明确)、Btk(Bruton酪氨酸激酶,影响B淋巴细胞的进化和功能)、Lyst(溶酶体运输调节)、FoxN1(编码交叉盒N1转录因子)、Prkdc(影响B和T淋巴细胞功能)以及H2(主要组织相溶性复合物)等[13,14,15,16,17,18]。这些突变小鼠是研究宿主对隐球菌免疫反应的遗传学特征的重要模型动物。例如,同样接种新生隐球菌,C5缺陷小鼠(DBA/2)将很快死于急性隐球菌性肺炎,但当接种量减少时将只产生迟发进行性脑膜脑炎。在该宿主中可以看出接种量对感染表现的重要性。相反,应用相同的接种量和菌株,BALB/c小鼠远比DBA/2小鼠生存时间长。这些结果突出表明了宿主因素对感染结果的影响。C5缺陷小鼠在组织病理学上显示对新生隐球菌炎症反应明显下降,可能与缺乏趋化因子C5a有关。与人类的致病有一定的类似的是易感小鼠可从肺部实验感染后播散到全身感染。尽管如此,目前还可以采用静脉注射和颅内注射的方法构建隐球菌播散性感染小鼠模型。曾有报道采用静脉注射方法构建隐球菌小鼠感染模型,证明小荚膜隐球菌可通过血液系统跨血脑屏障引起脑膜脑炎。而采用颅内注射方法构建小鼠隐球菌感染模型,证明了神经系统内吞噬细胞吞噬菌体是模型小鼠存在的重要因素。构建小鼠隐球菌感染模型的接种方法多种多样,其中腹腔注射接种方法最为方便,一般所需的病原菌量为105～107CFU。但是经腹腔注射接种的方法是否可引起大脑等其他器官播散性感染存在的不确定性,即有些模型可能易引起中枢神经系统感染而有些则不能。静脉注射接种法是最标准化和最容易定量的技术,所需的菌量一般为103～105CFU就可引起播散性感染,如肺、肝、脾、肾以及脑膜炎等。但采用静脉注射接种法所构建的模型动物内脏菌负荷可随时间的延长而下降,最终仅留有脑部感染存在,这在一定程度上也显示了隐球菌感染的过程。气管吸入或鼻饲法接种可能是最接近自然感染的方法,一般通过吸入含103～104CFU的30～50μL菌液来构建,需要麻醉模型动物后将该菌液滴入鼻腔使其吸入。该方法需要注意的是其麻醉的深度问题,深度应达到抑制小鼠吞咽功能以防止菌液“吞入”消化道。如果麻醉太浅可能使吸入菌量太小而大部分被吞入消化道或者被喷出鼻腔,而麻醉太深可导致实验动物无法吸入菌液。在实际操作中应使实验动物处于垂直位并将其嘴部闭紧以确保菌液能更好地被吸入肺部。颅内接种可使我们直接研究隐球菌在中枢神经系统内的增生情况,中枢神经系统是隐球菌感染最重要的部位。颅内接种可通过在脑后半部用细小针头插入至脑皮质约1～3mm