观赏植物花色基因工程研究进展

观赏植物花色基因工程研究进展

颜色是植物的一个重要品质特征。狭义的颜色指的是花瓣的颜色。一般来说，花朵、雄蕊和菖蒲也可以用作花瓣（程金潮，2000）。花色的优劣直接关系到观赏植物的观赏价值和商业价值,特别是近年来随着经济的快速发展,人们对花卉的需求也日益增加,那些具有新奇花色的观赏植物具有广阔的市场前景。自然界花卉颜色种类繁多,但是一些重要花卉的色系却有限,如月季、香石竹、郁金香、菊花等缺乏蓝色和紫色,天竺葵、仙客来、非洲紫罗兰、翠菊等缺乏黄色,球根鸢尾、紫罗兰等缺乏猩红色或砖红色,因此花色改良一直是育种工作者追逐的重要目标。然而花色在生化和遗传上都极为复杂,传统育种技术在花色育种上就显得力不从心。蓬勃发展的基因工程为观赏植物花色的基础研究和品种选育带来新的思路和途径。它可以导入控制某种(些)性状的基因而扩大其基因库,可以定向修饰观赏植物的某个(些)性状而不改变其原有性状,因此可在保持原有性状的基础上,改变观赏植物的花色,甚至创造该物种所不具有的花色,在较短时期内培育出稳定遗传的新品种、新类型。观赏植物花色基因工程较之其他作物基因工程有诸多优点,首先由于花色素的明显可见性,遗传操作的检测简易;其次因其用作观赏而非食用,因此安全性考虑较少;此外花色基因工程孕育着巨大的经济效益。因此它一方面是研究基因表达、调控和互作的热点课题,另一方面又逐渐成为许多生物工程公司培育新奇花卉品种、创造经济效益的重点产业。近年来花色基因工程已取得了瞩目的进展。1类黄酮copogmen花色是光线照射到花瓣上穿透色素层时,部分被吸收,部分被海绵组织反射折回,再度通过色素层而进入我们眼帘所产生的色彩。因此它与花瓣细胞中的色素种类、色素含量(包括多种色素的相对含量)、花瓣内部或表面构造引起的物理性状等多种因素有关,但花色素起主要作用。与花成色有关的色素包括叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮、水溶性生物碱及其衍生物四大类群,其中水溶性的类黄酮可产生从浅黄到蓝紫的全部颜色范围(郑志亮,1996)。花的成色作用还受以下因素的影响:①细胞内pH值:花瓣表皮细胞液泡pH值发生变化,常引起花色的改变,通常随着pH值上升,颜色逐渐由红变蓝(郑志亮,1996;邱辉龙和范明任,1998)。②分子堆积作用(molecularstacking):包括分子间堆积和分子内堆积,分子间堆积包括花色苷的自连作用(self_association)和辅助着色作用(co_pigmentation),即花色苷与辅助色素(copigment)结合而呈现增色效应(hyperchromiceffect)及红移(bathochromicshift),从而产生从紫到蓝色色系的现象,这种现象在pH1～7的范围内都可能发生,其产物对pH值的微小改变极其敏感(邱辉龙和范明任,1998;Tanakaetal,1998)。③螯合作用:色素常与细胞液中的Mg、Fe、Al、Mo等金属离子螯合,螯合后花色在一定程度上有所改变,往往偏向紫色(郑志亮,1996)。④花瓣表皮细胞的形状:细胞形状有利于增加细胞对入射光吸收的花,产生较深的色泽;反之,则产生明亮的外观(邱辉龙和范明任,1998)。2香石竹dfr、anas的结构及分类四大类色素都为次生代谢物,其合成涉及多个代谢步骤,由多种酶催化,因而与之相关的结构基因及调节基因也较多,它们的作用机理十分复杂。目前对植物中普遍存在的花色苷的合成途径以及与之相关的基因研究较为深入(Tanakaetal,1998)。花色苷合成的第一种关键酶是苯基苯乙烯酮(又称查尔酮)合酶(chalconesynthase,CHS),它与某些缩合酶(condensingenzyme)具有同源性,如拟南芥的FAE1和酮酯酰基(ketoacyl_acyl)载体蛋白合酶。黄烷酮_3_羟化酶(flavanone3_hydroxylase,F3H)是一种酮戊二酸依赖性的过氧化物酶,催化二氢黄烷酮(naringenin)生成二氢堪非醇(dihydrokaempferol,DHK,又称二氢黄酮醇,dihydroflavonol)。类黄酮_3′_羟化酶(flavonoid3′_hydroxylase,F3′H)和类黄酮_3′,5′_羟化酶(flavonoid3′,5′_hydroxylase,F3′5′H)属于同一细胞色素P450家族,它们决定二氢堪非醇B环的羟化模式,并最终决定产生花色的花色苷结构,F3′5′H是合成蓝色的花翠素_3_葡萄糖苷的关键酶。二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4_reductase,DFR)是催化DHK、DHQ(二氢栎皮黄酮)、DHM(二氢杨梅黄酮)分别形成无色花葵素、花青素、花翠素的关键酶,它可能属于3β_羟基甾体脱氢酶或DFR超家族。不同来源的DFR对三种底物的亲和性有所差异,如矮牵牛DFR主要催化DHM,其次是DHQ,而对DHK则无作用(吴少华和张大生,2002)。Jonson等(2001)鉴定了DFR与底物专一性结合有关的区域,并通过改变该区域的一个氨基酸使DFR优先催化DHK。无色花色素在花色素合酶(anthocyanidinsynthase,ANS)催化下产生有色花色素。DFR、ANS与花色的产生直接相关,香石竹DFR、ANS基因的转录水平随着花色从粉至红颜色加深而提高(Matoetal,2001)。类黄酮_3_O_糖基转移酶(flavonoid3_O_glycosyltransferase3GT)催化花色素的糖苷化,但在矮牵牛中发现一种不同于其他3GT的黄酮醇_3_O_半乳糖基转移酶(flavonol3_O_galactosyltransferase,F3GalTase),其仅存在于花粉,催化发芽所需的黄酮醇的糖苷化(Milleretal,2002)。3色彩育种手术3.1颜色基因的类型与克隆3.1.1类黄酮合成基因花色基因包括花色素基因、花色素量基因、花色素分布基因、辅助色素基因、转座子基因、控制花瓣内部酸度的基因等。Forkmann(1991)将这些花色基因分为以下几类:①控制类黄酮生物合成单个步骤的基因;②与类黄酮修饰有关的基因;③开关全部或部分合成途径的调节基因;④影响类黄酮浓度的基因;⑤与花朵结构有关的基因;⑥影响花色的基因或因子;⑦控制花瓣毛、乳突、色素细胞的形状和分布、角质层类型等形态特征的基因。3.1.2花色苷调节基因花色基因工程的第一步是花色苷生物合成途径结构基因的克隆。目前,利用转座子标签、PCR、蛋白质纯化与差异筛选等方法,已分离、克隆了多种花色苷结构基因。矮牵牛编码F3′5′H的基因Hf1和Hf2的表达均能使花色苷生物合成途径趋向于产生蓝色的花翠素_3_葡萄糖苷,从而使花趋于显蓝色。澳大利亚Florigene公司和日本Sandory公司的研究人员将矮牵牛F3′5′H和DFR基因导入缺乏DFR的白色香石竹,培育出紫色品种‘Moondust’,现已在两个国家销售,成为第一例上市的转基因花卉作物(Meyeretal,1987)。调节基因影响着结构基因的表达方式和表达强度,花色苷生物合成的每一步酶促反应均是调节基因作用的靶位点。利用转座子标签等技术现已分离出两类花色苷调节基因:一类是myc型转录因子,如玉米的R基因家族(R、S、Sn、Lc基因)和金鱼草Delila基因;另一类是myb型转录因子,如玉米的C1、Pl、P、Vp1基因(包满珠,1997;余迪求和李宝健,1997)。Goff等认为这两类转录因子相互作用激活结构基因的表达。不同植物的花色苷合成调节基因在功能上具有保守性,其中某些调节基因可在外源物种中发挥调节作用。将玉米Lc基因导入烟草,引起其花色由粉红变为深红。玉米B_Peru基因(myc型)转入白三叶(Trifoliumrepenscv.Haifa)引起其叶片着色方式的改变,且这种变化可稳定遗传(Majniketal,2000)。随着花色研究的深入,逐步明确了其他与花成色有关的基因功能,并克隆了其中一部分基因。部分已分离的花色基因如表1。3.2生物酶制剂的使用因为花色往往由多个代谢步骤、多基因决定,所以利用基因工程技术修饰这一性状的一个重要策略是还原法(reductionapproach),即欲修饰某个性状时,首先要明确决定该性状的特异生化物质,然后对形成该生化物质的代谢途径进行基因工程操作,具体就是分析催化各反应步骤的酶、编码这些酶的基因及其表达调控(傅荣昭,1995)。多步骤的代谢途径有限速步骤,而限速步骤对整个代谢途径起着决定性作用,所以对限速步骤的遗传操作往往是还原法的重要突破口。增强某种关键酶的表达,往往可使花色苷合成途径朝生成其催化产物的方向进行,而抑制该酶的表达,则会使反应朝合成途径的另一分支进行,导致另一种产物的积累。因此增强F3′5′H、DFR的表达分别是培育蓝花和砖红色花品种的一个切入点。3.3色彩检测的方法3.3.1chs基因突变植株利用基因工程技术进行花色修饰的常用方法是反义抑制法(或称反义RNA法,AntisenseSuppression),即首先明确决定花色的特异生化物质,然后分析该生化物质代谢途径中催化各反应步骤的酶,克隆编码这些酶的基因,反向转入到目的植株中,外源DNA转录产物与内源的互补mRNA结合,从而抑制目的植株中这些生化物质的合成,产生花色突变(何小玲和王金发,1998)。利用该技术已在矮牵牛(Vanetal,1988)、菊花(Guttersonetal,1994)等几种观赏植物中进行了成功的花色修饰。1988年VanderKrol等首次将反义CHS基因导入矮牵牛中,可抑制花色苷的形成,引起花色改变。反义CHS基因导入非洲菊,导致花瓣着色异常(Elomaaetal,1993)。Gutterson等通过根癌农杆菌介导转化法,将一个从菊花中分离到的CHS基因,以反义和正义方向分别导入开粉红色花的菊花中,获得开浅红色和白色花的转基因植株,对照组没有白色花,进一步研究表明,转基因植株的开白花性状通过营养繁殖绝大多数能稳定遗传。Aida等(2000)用相同的方法将CHS或DFR基因导入蓝猪耳(Toreniahybrida),结果反义方向导入的转化株花色均一变亮,而正义方向导入的转化株花色不均一变亮。目前反义RNA技术的机理尚未明了,可能是作用于基因的转录、翻译水平。3.3.2．有利于抑制内源基因的表达共抑制法(cosuppression),又称有义抑制法(sensesuppression),即正向导入一个(或几个)内源基因的额外拷贝,反而抑制该内源基因转录产物mRNA的积累,进而抑制该内源基因的表达(Napolietal,1990;Rjorgensenetal,1995)。该技术在矮牵牛(傅荣昭,1995)、菊花(Guttersonetal,1994)、蓝猪耳(Suzukietal,2000)等花卉的花色修饰方面已取得成功。共抑制引起花色多样性的分子机制尚不清楚,初步分析认为,同源顺序的存在可能是产生共抑制效应的基础,它与反义RNA的作用机制可能有某些共同之处,即都存在基因互作效应(洪孟民,1994)。3.3.3矮牵牛花开砖红色花即将欲修饰的供试株及其近缘种植物中原先不具有的一个(或几个)基因导入其中,从而使该受体植物增加一个(或几个)新的性状。Meyer等(1987)首次将源自玉米的编码DQR的A1基因导入矮牵牛白花突变体中,产生了开砖红色花的矮牵牛。蔷薇缺乏编码合成蓝色色素——花翠素的关键酶F3′5′H的基因,1992年,澳大利亚CalgenePacific公司与日本Sundory公司合作向蔷薇中导入该基因获得成功,同年该公司在矮牵牛中导入该基因获得蓝色矮牵牛(苏焕然等,1996)。3.3.4花的调节基因此外,在花色基因工程操作中,也可以导入调节基因以增强或减弱原有代谢产物表达,或导入其他与花成色作用有关的基因,如ph基因、辅助色素基因、细胞形状基因等,也可以同时导入与某种花色有关的多种基因。Quattrocchio等(1993)将一系列花色苷合成的调节基因导入矮牵牛,获得粉色花。Kim(2001)将玉米C1基因通过农杆菌介导转化烟草,转化株花瓣变狭长,颜色显著变浅。多基因同时导入对培育蓝色月季具有重要利用价值,因为蓝色月季须具备三个条件:花翠素、辅助色素黄酮醇、较高的pH值,目前Suntory公司和CalgenePacific公司等正在进行这项工作。4我国观赏植物结构基因研究的现状21世纪花卉业竞争是品种和技术的竞争,掌握丰富的资源和先进的技术,势必会在竞争中处于主动地位。近十年来,花卉基因工程的发展正日益加快,很有可能给花卉业带来革命性的影响。花卉业发展水平较高的发达国家早已意识到要占领国际市场就必须不断地培育出更新颖、更美丽的花卉品种,观赏植物的基因工程为此带来希望和契机。发达国家已在观赏植物的花色基因工程上开展了大量的基础和应用研究,并取得了有效的成绩,具备明显的竞争优势。我国在