猪蓝耳病病毒的培养研究

猪蓝耳病病毒PRRSV-TJMF92株的培养研究摘要：病毒培养在动物疫苗产业中起着十分关键的作用，其操作过程中的很多细节直接影响毒液的效价及疫苗的质量。本研究主要从接毒及收毒时间，毒液冻融时间的选择几个小方面探讨蓝耳病PRRSV-TJ-M株在Marc-145中的培养，以探索其最佳条件。关键词：蓝耳病毒；Marc-145；细胞培养；接毒；收毒；病毒培养前言高致病性猪繁殖与呼吸综合征PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV所引起的猪的一种高度传染性疾病，主要引起妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪发生呼吸道症状、仔猪高死亡率等造成直接损失，同时还会导致免疫抑制而继发多种其它疾病［1］。目前.该病在全世界几乎所有养猪地区都己流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失⑵，引起了国内外学者的广泛关注。Marc—145细胞，上皮样细胞，来源于猴肾细胞，可连续传代培养。此细胞常用于病毒的培养，特别是对PRRSV具有较高的敏感性，具有适应能力强、CPE产生早、产毒量高等优点，故蓝耳病毒培养多用此细胞［3］。1.病原1.1病原特征PRRSV呈球形或椭圆形，有的中心略空，有囊膜，直径大小约为45〜65nm，核衣壳直径大小约25〜30nm，表面有纤突。PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，是单股正链有囊膜的RNA病毒，基因组大小13〜15kb［4］。PRRSV病毒粒子直径约为45〜80nm，内含一个电子致密性的二十面体对称，直径约为25〜30nm的核衣壳，内含单股线状正链基因组RNA，长约15kb，是四种动脉炎病毒成员中最大的。病毒粒子表面有纤突，用乙醚和氯仿等脂溶剂处理可灭活病毒，证明PRR一SV有囊膜［5］。1.2培养特性研究表明，无论在体内或体外，PRRSV均可在单核细胞——巨噬细胞系统（包括肺泡巨噬细胞、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞等）中增殖。PRRSV在PAM细胞上可得到有效地增殖，毒价较高，而外周血单核细胞增殖的PRRSV毒价则较低。另外还发现猪脾巨噬细胞，脑小胶质细胞，传代细胞如Marc-145、CL2621等也能支持PRRSV的增殖［6］。而大量的人源或其他细胞系不能刚于PRRSV的增殖。相对而言以Marc-145细胞增殖PRRSV效果最好，最高毒价可达108.5TCID5°/0.1mL。无论是原代细胞还是传代细胞，PRRSV均在细胞浆内复制，且CPE相似，5即细胞圆缩、集聚、然后固缩、最后脱落。1.3理化特性在从临陆床样品中分离病毒时，常温25°C以下病毒在血清中可维持其活力，但在组织中失活较快［7］。PRRSV在低温下较稳定，在4C以上则逐渐失去感染性，4C1个月，20C6天，37°^0-20上在一70C条件下病毒的感染性可保存4个月以上不变。该病毒在PH5—7之间保持稳定，当pH小于5或大于7的条件下，病毒的感染滴度降低90%以上。PRRSV对多种动物的红细胞无凝集特性，不凝集猪、牛、绵羊、山羊、兔、鸡、鸭、豚鼠、小白鼠和如型红细胞。PRRSV不凝集经肝素酶处理的小鼠红细胞，并证明PRRSV抗血清的血凝抑制效价与中和抗体效价具有关系［8］。流行病因猪通过呼吸系统感染PRRSV，因为PRRSV对巨噬细胞的嗜性，侵入的PRRSV首先在鼻粘膜、呼吸道上皮细胞及肺内巨噬细胞中增殖，特别是尚未成熟的PAM细胞最适合PRRSV的繁殖，在PAM中增殖的PRRSV可转移到局部淋巴组织的巨噬细胞和单核细胞内进一步增殖，使肺部的PAM、单核细胞等免疫相关细胞大量减少，造成肺部的免疫抑制，从而在仔猪出现典型的呼吸道症状；同时，因PRRSV的增值导致PAM减少，PAM依赖于超氧负离子发挥杀菌作用的功能被剥弱.这样就为其它病原微生物的继发感染创造了有利条件，使疾病的症状加重［9］。PRRSV在肺部PAM、单核细胞大量增殖后，随着细胞的崩溃，释放出的PRRSV进入血液循环和淋巴循环。在血液内巨噬细胞和单核细胞内增殖，结果导致病毒血症的出现及全身淋巴结的感染和肿大。在细胞水平上，病毒抗原主要定位于肺、脾、淋巴结、胸腺、扁桃体、鼻甲骨、睾丸、肾、肝、肾上腺、脑、肠等巨噬细胞内，在生殖道细胞内也可检出，表明PRRSV存在对生殖系统的感染，通过诱发睾丸内精子细胞凋亡使精子数量减少，公猪则表现出繁殖性能的降低，这种公猪通过精液将PRRSV传染给母猪，引起母猪的繁殖障碍。接着PRRSV由能穿过胎盘屏障的单核细胞和巨噬细胞携带，从而进入胎儿体内引起胎儿的感染［10］。发病特征此病不分年龄和季节，各龄猪均可发生，一般流行期为70〜100天。在同一猪场里爆发此病停息后，容易再次爆发，且发病率显著提高，可见其免疫力低，病毒活力很强。此病只感染猪，不感染人和其他动物，蓝耳病的与仔猪的迁移运输有密切的关系。4.1临床症状PRRSV在易感母猪群内传播、感染、诱发流产，其流行形式从散发性到大爆发不等。猪群中15%的猪能够逃避初期感染，却又会造成易感猪的持续性感染。PRRSV导致的母猪流产，其表现时间短则10〜12周，长则4〜6个月。妊娠后三个月的母猪如果感染PRRSV，则会表现流产、早产、胎儿自溶和木乃伊等典型特征。被感染的猪有的不表现出症状，有的表现厌食、发热、昏睡、肺炎、缺乳、蓝耳、外阴和皮下以及后肢水肿、断乳延迟及返情等症状，少数死亡［11］。出生前后感染PRRSV的新生仔猪，呼吸困难、急促，同时出现眼周及眼睑水肿，结膜炎，蓝耳，食欲不振，发热，皮肤红斑，腹泻，震颤，毛发粗乱，厌食和神经症状［12］。患病仔猪所表现的临床症状差别很大，其中呼吸困难、急促是最典型的症状。患病新生仔猪的致死率高达100%。断乳仔猪感染PRRSV的典型临床症状表现为发热、肺炎、昏睡及精神萎靡，如果伴发细菌感染，则死亡率显著升高［13］。PRRSV与细菌混合感染也是造成未成年猪高死亡率的一个重要原因。一种或多种细菌及其他病毒混合感染使得PRRSV感染更为复杂。与传统猪蓝耳病比较，今年爆发的高致病性猪蓝耳病在临床上以“三高”为主要特征：高体温、高发病率和高死亡率。具体表现为发病猪出现41°C以上持续高热，发病猪不分年龄段均出现急性死亡，发病率可达100%，死亡可达50%以上，母猪流产率可达30%以上，临床症状包括发烧、厌食或不食；耳部、口鼻部、后躯及股内侧皮肤早期发红，后期发绀，另外伴有眼结膜炎、咳嗽、喘等呼吸道症状和摇摆、抽搐、行走困难等神经症状［14］。诊断方法根据妊娠母猪后期发生流产、新生仔死亡率高、其他猪临床表现温和以及间质性局灶性肺炎变化可做出初步诊断。但确诊则有赖于病毒的分离鉴定及血清学检查［15］。本研究的目的及意义影响细胞培养的条件很多，由于条件限制，不能全部研究。本试验主要探讨Marc-145细胞传代的最佳时间，接毒及收毒的最佳时间，以及毒液的冻融时间。旨在探索提高单细胞产毒量、降低生产成本、提高生产效率的方法。研究内容试剂与器材1.1材料Marc-145细胞，PRRSV-TJM-F92株。1.2试剂Hyclone胎牛血清，试剂，营养液MEM，胰蛋白酶。1.3主要仪器设备细胞观察台，转瓶机，细胞培养瓶，净化工作台、离心机、恒温水浴箱、滤器、冰箱等常规仪器2.方法2.1细胞培养包括细胞的复苏、传代、冻存等几个主要部分。2.1.1细胞的复苏从液氮罐中取出一管Marc—145细胞，37C水浴快速溶化，移入装有预热的10ml生长液的高压灭菌离心管中，2000r/min，37C离心5min，弃去上清，加1ml生长液，用巴氏吸管轻轻吹打，将沉淀的细胞分散，移到100m1的细胞培养瓶内，加入7ml生长液，放置37°C温室传代培养。细胞培养液的配制：MEM基础培养基中加入血清，血清浓度为10%。2.1.2传代Marc一145属于贴壁型细胞，当原来分散在细胞液中的细胞一经贴壁后就迅速铺展呈多角状态随后开始有丝分裂，并很快就会铺满生长表面，形成致密的细胞单层，当细胞长到相互接触时，会出现“接触抑制”现象，细胞继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，此时细胞停止分裂增殖，就必须进行传代。将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；在倒空的细胞瓶中加入胰蛋白酶-EDTA消化液；一手抓瓶颈，一手托瓶底，平稳匀速摇动，使消化液充分浸润细胞瓶内壁，消化约1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明(细胞单层连接成片)转为透明、点状(出现细小空隙)时，弃去细胞消化液，并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；将培养液分入多瓶继续培养，本实验采取一传三方式。将传好的细胞瓶封口标记，放入37C+0.5C的温室中继续培养。一般细胞长到培养表面的75%〜80%时传代效果较好。2.1.3细胞的冻存传代细胞应有充足的冻存储备，以备后用，在细胞培养过程要不断的对细胞进行冻存.细胞冻存和复苏需遵守慢冻快融原则。冻存液的配制：冻存液中应含20%血清和10%二甲基亚砜(DMSO)，DMSO是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，从而减少细胞损伤。细胞冻存程序：取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打成细胞悬液。将细胞悬液分装入冻存管，密封后标明细胞的名称和冻存时间。降温程序为：40C30min—-20Clh—-70C10h—转入液氮罐。2.2病毒培养疫苗制备时该步骤包括接毒、收毒、毒液冻融及混毒。2.2.1接毒分细胞挑选、溶液配制、接种培养三步2.2.1.1细胞挑选：选择无污染，形态正常，形成90%以上单层的细胞，以备接毒。2.2.1.2溶液配制：在MEM基础培养液中加入血清，使其最终浓度为1%〜2%。2.2.1.3分装培养将细胞瓶用消毒布擦拭外表后摆到操作台上，揭开瓶帽，用火焰消毒瓶口及瓶颈。倒掉细胞培养液，倾倒废液时应防止液体反溅入细胞瓶内。废液倾倒完毕后，在火焰控制下，无菌操作加盖胶塞，对细胞培养瓶瓶口再进行火焰消毒，置于操作台上，待接种。将种毒加入配液桶，终含量为维持液的0.8%——2%。在火焰控制下，同时去掉分装罩的纸帽和细胞瓶塞，将分装罩加载细胞瓶口上，同时胶塞放在酒精灯下或火焰上方，以达到无毒。将维持也通过滤器和分装罩装入细胞内，待病毒液的量达瓶10%时，移开分装罩以同样方法加入下一瓶，并立即加盖前一胶塞，注意无菌操作。盖上瓶帽、捆扎瓶口，并在细胞瓶上标记接毒批次，品名和日期。细胞接毒后，置于37°C±0.5°C环境中培养，观察细胞病变。此处为了研究接毒的最佳时机，分别在细胞传代后的28h、38h、48h、58h、68h接毒。2.2.2收毒细胞接毒后定时观察细胞，当出现CPE后，根据细胞病变程度，每4小时左右观察一次病变发展及状态。方法：抽取不同转瓶机上不同培养层的细胞瓶进行观察，显著病变细胞一般肉眼观察瓶壁发暗，镜下视野中细胞融合，形成胞合体，或细胞圆缩脱落，或形成包涵体，当病变大75%以上时可收毒，放入冷库，使其冰冻。为研究收毒的最佳时机，分别在接毒后的18h、30h、42h、54h、66h收毒。2.2.3毒液的冻融为释放细胞内病毒，以制备疫苗，需将毒液冻融为研究冻融的次数及冷冻时间，可将毒液分成6份，标做ABCDEF。冻融情况如下表所示：冻融次数一次冷冻时间/hA112B124C212D224E312F3242.2.4混毒2.2.4.1无菌控制下，将细胞瓶内毒液倒入毒液贮藏瓶内，操作过程中若发现毒液污染，颜色明显异常的，细胞瓶破裂的应淘汰。2.2.4.2当全部混合完毕后，按顺序贴好标签，并标记。2.2.4.3毒液混合后瓶口用火焰消毒，再用吸管取样，逐瓶进行无菌检验，在无菌检验管上标明对应的批号，品名，代次，瓶号及日期，后置于37C±0.5C环境中培养。取样吸管内剩余毒液按比例混合在取样瓶内摇匀后分成三份，为TCID测定样品及两份备用样品，样品瓶用胶塞封口，并贴上对应的标签后置于冷库冻存，备检。2.2.4.4检验完毕的毒液立即封口，及时放入半成品库保存。2.3毒液的毒价测定将各待检样品分别做10倍系列稀释，取其中10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种于已长成单层的Marc-145细胞96孔细胞培养板中，每个稀释度接种6孔，0.1mL/孔，另设6孔只接种稀释液作为空白对照，0.1mL/孔。吸附1h后各孔加维持液，置于37C、CO，培养箱中培养【62】120h，每天观察各孔细胞病变情况，并及时记录结果，按Reed一Muench法计算TCID/3.实验结果与分析上图为正常Mard45细胞(A)及形成细胞病变的Marc-l45细胞(B)。3.1接毒时间实验研究表明，在细胞传代后48h接毒，收获后毒价最高，38h和58h相差不大，而28h和68h则明显较低，这可能由于细胞生长未到达或已过对数期，细胞活力不足引起。接毒时间/h2838485868TCID50/lg-mL-i6.827.317.567.487.053.2收毒时间实验结果表明，在接毒后30h、42h、54h收毒，收获后毒价最高，且相差不大，而其他过长或过短的时间收毒，毒价都较低。时间过短，病毒未完全侵染细胞；时间过长，可能是维持液中营养成份消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，细胞生长状况不良，影响毒价，也可能是部分病毒从细胞中释放出来时间太长而被灭活，此处问题有待研究。总之收毒时间过早或过晚，病毒的滴度都不高收毒时间/h1830425466TCID50/lg•