第二章 环境生物技术的生物学基础

第二章环境生物技术生物学基础

第一节酶工程酶工程：是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。其主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥出最大的催化功能；目的是为我们提供产品或以特定的功能为我们服务。1、生产、分离纯化2、酶分子修饰3、酶的固定化4、酶的应用一、酶的生产及分离纯化（一）酶的生产1.对酶源的要求酶含量丰富提取、纯化方便2.微生物作为酶的优势易得到所需的酶类易获得高产菌株生产成本低微生物生长周期短生产易管理提高微生物产酶能力的途径较多可提高酶产量或改造酶3.对酶生产菌的要求1）不是致病菌，也不产毒素2）不易变异退化，不易感染噬菌体3）产酶量高，而且最好产生胞外酶4）原料廉价，周期短，易培养（二）酶的分离纯化酶的分离提纯可分为四个要点：酶源选材匀浆方法分离步骤结晶方法酶的分离提纯涉及的理论与技术：酶主要是蛋白质酶具有催化功能酶分离提纯步骤如下：半匀浆选材提取液粗酶制品精制细胞器纯酶酶结晶抽取或分散亲和分离法少量酶分离方法结晶法1.酶提取定义：是将酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以供进一步从中分离纯化出所需的酶。1）组织及细胞的破碎（1）物理法（包括机械法）（2）化学法（3）酶解法2）酶的提取原理———相似相溶常用方法：（1）酸、碱、盐溶液提取（2）有机溶液提取2．酶分离纯化的沉淀技术1）盐析———溶解度的差异盐溶－低浓度的中性盐可增加电解质类物质的溶解度；盐析－当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度反而降低而析出。（1）基本原理a.减弱了蛋白质的水合程度b.中和了蛋白质电荷，使静电荷减少（2）影响因素a.蛋白质的浓度b.介质的pHc.温度d.盐类型2）PEG沉淀法———溶解度的差异（1）基本原理空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。（2）影响因素a.蛋白质的分子质量——大，沉降好b.蛋白质浓度c.pH值d.离子强度e.温度f.PEG聚合度3)有机溶剂沉淀法——溶解度的差异（1）基本原理a.介质的介电常数下降，增强静电作用力b.降低水合程度（2）常用方式a.分级沉淀有用的蛋白质b.杂蛋白质变性（3）缺点——易使酶变性，低温操作4）等电点沉淀法——溶解度的差异蛋白质在等电点（ｐI）处，净电荷为0，易于沉淀。5）热变性沉淀法——热稳定性的差异

可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。3.酶分离纯化的层析技术

层析分离——是利用混合物中各组分的物理化学性质｛分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数｝的不同，使各组分的分布程度不同而达到分离。1）凝胶过滤层析——分子大小和形状的差异基本原理酶液中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，从而实现分离纯化。优点条件温和，操作简便，分离范围广，回收率高，层析柱可反复使用，无需再生处理,可分段分离。常用的凝胶交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶2）离子交换层析——电荷性质的差异它利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的亲和力不同而进行分离。（1）基本原理蛋白质是两性电解质，不同蛋白质由于其pI不同，在同一种pH值介质中电离状况不同，分子所带电荷种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力也不同。通过吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱，可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。（2）洗脱方法a.梯度洗脱b.阶段洗脱3）亲和层析——亲和力的差异（1）基本原理利用配基与酶结合能力而将目的酶分离出来。

（2）载体a.应具有均一、坚实、多孔的网状结构b.亲水c.具有可活化和改变的化学基团d.具有良好的化学稳定性交联琼脂糖凝胶

(3)配基a.配基与酶的亲和力b.配基与载体的结合方式引入手臂可避免配基在载体上密度太大而造成的空间障碍。W-氨烷基化合物4）高效液相色谱（1）基本原理用检测器检出，由收集器收集同一色谱的目的酶。（2）HPLC的优点：分辨率高；快速，整个分离过程仅几十分钟；灵敏度高；一根柱可分析多个样品，而无需重新填装柱。4.酶分离纯化的电泳技术电泳—带电物质在直流电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。区带电泳——样品溶液在一惰性支持物上进行电泳的过程。电泳后，不同的蛋白质组成被分离形成带状区间。区带的位置可用专一蛋白质染料染色显示，有些也可利用伴有颜色变化的酶催化反应来显示。区带电泳的方法很多，在酶分离纯化中常用的有：1）聚丙烯酰胺凝胶电泳2）等电聚焦（一）问题的提出1、定义———通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。利用的是“结构决定功能”。2、修饰目的1）提高酶活力；2）增强稳定性；3）环境可改变；4）改变最适pH或T；5）改变酶的特异性；6）改变催化类型；7）提高反应效率。二、酶分子修饰3.修饰方法1）金属离子置换修饰；2）大分子结合修饰；3）肽链有限水解修饰；4）酶蛋白侧链基团修饰；5）氨基酸置换修饰。4.现在进行的工作1）设法使酶的活性结构加固；2）通过化学修饰或酶法修饰改变酶的活性；3）设法消除免疫性或抗原性以利于医疗应用。

1.定义通过化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，以改变酶的物理化学性质，达到改变酶的催化性质的目的。化学修饰——是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，其目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。它主要是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定活化步骤与酶分子的某种氨基酸残基产生化学反应，从而改造酶的结构和功能。（二）酶分子的化学修饰2.修饰常用的方法1）部分水解酶的非活性主链；2）对活性部位或非活性部位以外的侧链基团进行共价修饰；3）辅酶因子的置换。3.常用的修饰剂1）酰化试剂；2）烷化剂；3）形成酯和酰胺的试剂；4）氧化还原试剂；5）亲电子试剂4.修饰时的注意事项1）对修饰剂的要求——分子质量大、生物相容性和水溶性好、反应基团多、半衰期长；2）对酶性质的了解——活性部位、最适条件、侧链基团的化学性质以及反应活性；3）反应条件的选择——酶稳定的条件三、酶固定化

（一）概述1.问题的提出1）酶的稳定性差；2）难回收；3）难分离纯化（产物与酶）。2.基本概念

酶的固定化——将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶——固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶的原料——纯酶、结合在死细胞或细胞碎片的酶或酶系（固定化菌体）1.吸附法——利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法常用吸附剂——活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。特点——操作简单、条件温和、不会使酶失活；结合力弱、易脱落。（二）固定化方法吸附法包埋法结合法分类2、包埋法——将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定。载体——琼脂、琼脂糖、海藻酸钠等。凝胶包埋法半透膜包埋法分类根据载体材料和方法1）凝胶包埋法——将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化菌体，大多数为球状或片状。

常用凝胶——天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胶凝胶、光交联树脂）2）半透膜包埋法——是指将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。

常用半透膜——聚酰胺膜、火棉胶膜等。

3.结合法——选择适宜的载体，使之与通过共价键和离子键与酶结合在一起的固定化方法。分类（结合键不同）：离子键结合法、共价键结合法1）离子键结合——通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体——不溶于水的离子交换剂特点——制备操作简单，活力损失较少，但使用时一定要严格控制好pH值、离子强度和温度。2）共价键结合——通过共价键使酶与载体结合的固定化方法载体——纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。1）酶活力回收率变化——是指固定化酶所保留下来的酶的活力与游离酶在固定化之前的酶活力之比。多数下降2）底物专一性变化——对分子质量大的活性下降3）反应的最适pH值变化——不同程度变化4）反应的最适温度变化——高5）米－门常数变化——多数偏大6）最大反应速度的变化——大多相同（三）固定化法对酶的影响四、酶的应用

1、酶获得广泛应用的原因1）酶的催化效率高；2）可催化广泛的化学反应；3）酶源多；4）酶可被修饰改造。2、酶用于污染治理的优缺点1)优点a.能处理难以生物降解的化合物；b.高、低浓度废水均适用；c.经修饰后其作用范围相对较广；d.过程控制较简便。2）缺点成本较高3、酶工程的发展展望（1）现状

生产酶制剂20多种，在食品、轻化工及医药工业中得到了广泛的应用。与国外相比不容乐观。特别是在以下领域：高产菌株的培育、酶制剂的制备工艺、提高产品质量。（2）发展展望生物传感器多酶反应器的研究酶的改造和新酶的开发酶的分离提纯技术酶的应用领域的扩展和生产工艺的改进第二节基因工程1.定义：将外源基因体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。2.理论和技术支撑（1）理论：40年代发现了生物的遗传物质是DNA、50年代弄清了DNA的双螺旋结构、60年代确定了遗传信息的传递方式。（2）技术：工具酶、DNA序列分析、载体3.基因工程实施至少四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞4.基因工程操作的基本技术5.基因工程在环境污染治理中的应用工具酶限制性核酸内切酶——“分子剪刀”一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。所识别序列的中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。DNA连接酶——“分子缝合针”将双链的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。目的基因的提取方法1）DNA序列自动测序仪：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。2）PCR技术：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。3）从基因文库中获取目的基因：基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因组文库:基因文库中包含了一种生物所