靶向PCR CTC检测技术

靶向PCRCTC检测技术——帮助临床医生更全面地评估肺癌LungCancerinSolidTumorinChina=？液态活检通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤病理活检通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤CTCctDNAmircoRNALNCRNAOthers

传统的组织细胞学检测液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发治疗策略事件疑似肺癌辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择耐药机理新药研发CTC的临床应用价值疗效评估CTC(数量）(负向富集+靶向PCR）ctDNA(基因变异）1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC）？肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2第9周的乳腺管组织切片：乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质CK+cellsHER-2+cells什么时候可以检测到CTC？早期肿瘤外周血中即可检出CTCWHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期肿瘤外周血中即可检出CTC表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象CTC富集技术密度与大小免疫磁珠（负向富集or阳性富集)微流体CTC

检测方法CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR=+“方法”“收获”“垃圾”蟹饵没水了，我们躲不了了放水负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低正向富集优势：纯度高劣势：回收率低（漏掉CTC）幸好没贪嘴，我们逃了“方法”“收获”“垃圾”没水了，我们躲不了了放水负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低大小富集（ISET）优势：简单劣势：漏掉小的CTC细胞幸好没吃胖，我们逃了网筛CTC检测技术检测原理肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达CTC：FR=1:50万EMT转化不影响FR丰度其他血细胞不表达FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自动化灵敏度超高，负向富集可满足检测要求信号二次放大，1个CTC信号放大10^12倍无需人工经验判读，结果客观准确可实现CTC的定量CTC检测

靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性

1个CTC信号放大1012倍CTC检测优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞优势二：靶向探针特异性高优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差3mL血1mL/3mL血3mL血1个CTC/3mL血50万FR/1个CTC1个CTC/1slide100万信号/1个FR1个信号/1个CTCFR靶向PCR——1个CTC细胞信号方法10^12倍（万亿倍）细胞免疫荧光——1个CTC细胞信号几乎没有放大CellSearch:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定EpCAM–上皮细胞粘附分子APC–异藻蓝蛋白荧光染料CK–细胞角蛋白PE–藻红蛋白荧光染料DAPI–4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）上皮细胞白细胞抗EpCAM磁流体EpCAM抗原CD45抗原CK抗原抗CD45-APC染料抗CK-PE染料荧光染料16EpCAM阴性细胞中，存在大量CTCCellResearch系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针

研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne20132004CellSearch:乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程3mL血→6个小时→得到报告检测流程肺癌领域，CTC检测技术对比CytoploRare®（格诺）CellSearch®CyttelTM（北京莱尔）CanpatrolTM（益善）CTC-BiopsyⓇ（武汉友之友)核心技术免疫磁珠负向富集靶向配体PCR技术

流式正向富集技术荧光标记免疫磁珠负向富集、Fish技术ISET（滤膜）原位杂交RNA分析ISET（滤膜)荧光标记特异性88%80%83%75%70%灵敏度80%30%腺癌：46%30%30%自动化半自动全自动半自动半自动全自动血样体积3mL7.5mL4mL5mL10mL适应症早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌肿晚期癌肿早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未报道未报道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%报告时间6h/12样本6h/8样本48h/1样本48h/1样本3天可视化否是是是是不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性CTC计数诊断肺癌敏感性诊断肺癌特异性2.09