.7.23涛哥答疑录(私聊版)

MJ:问题描述：首先是铺垫+个人理解样品垫中离子强度的问题，tirs和氢氧化钠造成碱性原因是不同的，tirs吸收水中的氢离子，使水电离产生氢氧根离子，而氢氧化钠直接电离出氢氧根离子，使溶液呈现碱性，所以个人认为如果单单是tris体系的缓冲液的话，溶液虽然呈碱性，但是离子强度较低，至少比相同摩尔浓度和酸碱度下，PB缓冲液的离子强度低很多。而您也说过，样品垫要保持适当的离子强度，来应对离子强度比较高的样本。个人觉得离子强度过高的话，会影响抗原抗体的结合，这个可能没有什么理论依据，只是个人觉得。问题1：如果要提高样品垫中离子强度（我目前比较偏好TB体系，因为离子强度小，个人有离子强度影响结合的直觉），是加入PB体系，并且提高浓度，还是说不加PB，转而加氯化钠？问题2：目前在做全血样品垫，大概的思路是：缓冲对+表面活性剂+抗RBC，筛选抗RBC的种类，切换浓度，看最适合的抗RBC的种类和量，这样的做法的话就要求缓冲对+表面活性剂这个母液种类最好相对定，不然组别太多了，目前打算用100mMTris+40mMPB+1%Brij-35尝试，想问下这样的思路有没有问题，或者有没有能改进的地方，要不您直接推荐个缓冲对+表面活性剂的配方？大概就是这样，应该够具体了吧，请解答下吧T:你的直觉很对首先，样品垫中离子强度的问题，tirs和氢氧化钠造成碱性原因是不同的，tirs吸收水中的氢离子，使水电离产生氢氧根离子，而氢氧化钠直接电离出氢氧根离子，使溶液呈现碱性，所以个人认为如果单单是tris体系的缓冲液的话，溶液虽然呈碱性，但是离子强度较低，至少比相同摩尔浓度和酸碱度下，PB缓冲液的离子强度低很多。你这段说的很对。TRIS相对于BBSPBSCBS这些确实离子强度低一些个人觉得离子强度过高的话，会影响抗原抗体的结合，这个可能没有什么理论依据，只是个人觉得。这个说的也对。首先呢，我们先对样品垫处理液的缓冲系统定下一个原则，要明白，样品垫处理液中，我们为什么要加入缓冲系统。加入缓冲系统的目的主要是纠正个体样本间PH的差异，也就是看重其缓冲能力。那么，缓冲系统在什么条件下缓冲能力比较强呢？任何一种缓冲系统都有一个最佳的缓冲范围，比如TRIS-HCL体系最佳的缓冲范围是8.0附近，大概是7.5-8.5之间。你在调整PH的时候，应该会有感觉：一开始加盐酸的时候PH降的很快，到8.5左右的时候PH就降的很慢了，低于7.5的时候又下降很快了，在8.0左右的时候是最慢的需要加很多盐酸，PH才会发生明显变化。而PB呢，其最佳缓冲范围在中性略偏碱性附近，也就是7.2左右。而硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液呢、最佳缓冲范围大概在9.0左右。所以，我们该如何选择缓冲系统呢？原则就有了：首先，我们会选择一个缓冲范围相对广泛的缓冲体系，然后调整各种PH，观察每个PH条件下的性能。比如，我们发现样品垫PH在9.0左右效果最好，那么，我们可以直接选择硼酸盐缓冲液。如果我们发现，样品垫PH在8.2左右效果最好，那就选择TRIS。如果发现样品垫处理液PH在7.0左右效果最好，那就选择PB。不过，这里面有个问题，如果你一开始用0.01M的TRIS，会发现各个PH条件下性能变化不明显。因为，这个浓度下TRIS的缓冲能力比较弱，也就是说一个缓冲体系的缓冲能力，不光跟PH有关，跟其使用浓度也有关。所以，最开始探索的时候，建议用0.1M的tris这样结果差异会更明显。你刚才说到一点，离子强度会影响抗原抗体的反应，这点很重要，抗原抗体的免疫反应主要就是那几个作用力，而电荷对这些作用力的干扰是很明显的，这种干扰不光体现在电荷的正负而且体现在数量上，所以合适的离子强度是很重要的，抗原抗体的反应有一个最佳的离子强度范围，这个需要探索，当我们选择一种缓冲系统之后一般PH会首先确定下来，接下来要对缓冲系统的浓度进行筛选。比如我们选择了0.05M的Tris，此时，性能能够达到最佳状态，然后我们在这个缓冲系统基础上，添加其它物质，用于进一步改善产品的性能。如果在性能评估和工艺调试过程中发现体系的抗干扰能力偏弱，比如你做早孕的项目，不同个体尿液的离子强度差异很大，有的会造成假阳性，这个时候你就需要考虑增强体系的抗干扰能力，如何屏蔽个体样本离子强度的差异，这个我之前应该给你讲过，通过高盐的加入，可以达到这个目的，这个时候再加入氯化钠。也就是说氯化钠不是工艺体系所必需的组分，是根据需要而加入的，起辅助功能。有时候单纯靠提高缓冲系统的浓度并不能完全解决问题，一味提高可能会出现副作用，这个时候就该考虑换个思路，加氯化钠配伍一下，几种物质的配伍往往能够解决矛盾的问题，你想想看，整个体系是一个整体，牵一发而动全身，如果我们加入氯化钠之后体系的抗干扰能力增强了，但是灵敏度变弱了，咋办呢？需要通过其它的方式再去增强，也就是说我们一边降低灵敏度，一边又升高灵敏度，表面看来是做了无用功，实际上，我们提高了整个体系的抗干扰能力，基于不同的方法，对产品灵敏度的条件，都是为了解决特定的矛盾的问题。第二个问题首先你的思路是对的就是，先用最基本的工艺，来确定RBC的用量，不过，你这个母液不太合适。你为毛打算用两种缓冲系统呢？你加两种缓冲系统有点不伦不类，另外可能会互相影响缓冲范围和缓冲能力。另外Brij35并不是最常用的一种表面活性剂，其主要是为了增加特异性，建议用常规的非溶血性表面活性剂，当然你用Brij35也没错，只是我个人不习惯而已。MJ：手头有t20、t80、曲拉通100、s9、birj35哪个好？T：S9吧，S17也行，S17我那有。另外，检测血液的，表面活性剂没必要这么高浓度，一般0.5%-0.75%比较好。MJ：为毛不需要那么高？T：你用非溶血性的表面活性剂，往往都是固态的，比如S9，量多了容易粘稠，反而不利于层析。第三个问题，我可以先跟你说说，其实，鼠抗、兔抗、本身都不是问题，不存在哪个更好，而在于哪个更合适。红细胞表面有很多抗原表位，其中一些表位是重复的，也就是多价的。这些重复的表位在参与免疫反应的时候很容易导致凝集反应，因此如果你用了一个单抗，这个单抗呢针对的红细胞抗原表位是最丰富的，而且这个单抗的亲和力很强，那么客观上来说这个单抗导致红细胞凝集的效率就会很高，此时，多抗就显得有点逊色了。因为多抗是有众多单抗组成的，其中一部分单抗，其实根本发挥不了作用，因为，他们针对的抗原表位太单一，不能形成明显的凝集反应。MJ：万一多抗里80%的抗体都只能结合一个红细胞，剩下的20%去形成网状结构的话，那岂不是很纠结？T：当然，一般不会这样的哈，因为，免疫过程是有选择性的，也就是说，机体往往对免疫原上面免疫能力强的表位产生很强的应答。也就是说，一般来讲，多抗里面大部分还是针对红细胞的多价表位的。如果这个单抗亲和力偏弱呢，就不好说怎么样了，如果这个单抗针对的抗原表位太单一呢，就没啥用了。当然，这样的单抗供应商是不会出售的，但是单抗的亲和力毕竟存在差异，所以不同厂家提供的单抗性能就存在差异，有的厂家的单抗比多抗效果好有的则相反，因此单纯说单抗好，还是多抗好没有意义。多抗的好处就是：虽然我考不了100分，但是我一般不会低于80分。另外还有一点，也是选择的原则之一，就是对质控线的影响，如果你某个产品采用了间接质控，比如说你HIV的项目你不想做直接质控，而做一个间接质控比如你标记一个兔IgG，然后C线用羊抗兔，那么如果你RB选择了兔多抗，就有问题了。游离兔抗体太多了，会导致C线不显色。再比如，你肌钙蛋白I的项目标记的是鼠单抗，C线用的羊抗鼠，那么如果RBC是鼠单抗，对C线的显色也会产生影响。还有一点，关于阻断剂，阻断剂从本质上来讲也是一种鼠源抗体，阻断剂的用量还不至于对质控线形成致命的影响。如果你的RBC是鼠源抗体，阻断剂也是鼠源抗体，客观上如果是HAMA阳性样本，你的鼠抗红细胞抗体会跟HAMA反应的，如果说好事呢，也算好事，起码RBC抗体协助了阻断剂来消灭HAMA，这个属于援助，但是，消灭HAMA，不是RBC抗体的任务，他这属于帮别人完成了任务，他自己的任务呢？兵力分散了，效果肯定要受到影响啊。比如，你这个HAMA阳性样本是一个全血样本，30%的RBC抗体去结合HAMA了，剩下70%的去凝集红细胞，效果就大打折扣了。我说这个的意思并不是是用鼠源RBC抗体就一定会产生消极的影响，而是说你在进行RBC的筛选和用量控制的时候一定要考虑到这些问题，另外就算你用的兔源RBC抗体也面临同样的问题，因为类风湿因子跟很多种属的抗体都会发生反应，简单点说，比如你RBC用量探索的时候1ug/人份，效果就够了1.5ug也行，就尽量用1.5ug。什么源的都会遇到一些问题，所以如何去屏蔽这些问题合理选择RBC抗体种类及用量是一门学问啊。MJ：还有几个小问题明天我就100mMtris+0.5%的S9pH=8.5作为母液上？筛选抗rbc种类和浓度T：就这个，先用最简单的，这个没问题之后再有针对性调整。有这样的说法MJ：有这样的说法，ph8.7最适合抗原抗体反应？还有brij35增加特异性是怎么回事儿？T:额，抗原抗体的反应，在体内，PH7.2左右是最合适的PH，但是在体外就不一定了，特别是当体系中含有其它各种组分的时候，这个最佳的PH就千差万别了，所以一般来讲每个项目每个原料都是要探索的。当然，很多时候，我们不会做的这么仔细一般做的东西做了，也就大概有个印象了。所以PH8.7这个说法就是欠揍。BRIJ35增加特异性的机理在于改变蛋白的三维构象进而使其容易产生非特异性反应的活跃位点隐藏起来，至于其如何达到这种效果的，不好解释。影响蛋白三维构象的物质，归根到底，就是那些可以影响氨基酸之间作用力的物质，比如疏水作用力对表面活性剂敏感，比如静电作用力对PH和离子强度敏感。MJ：最后一个问题是：抗体、或者说蛋白，在我的印象里应该是液体保存在缓冲液里面的，固体在NC膜或者在金殿上我就认了，抗体直接放在样品垫上，会不会很容易歇菜?T：抗体直接放在样品垫上会吸附样品垫的，就如同抗体容易吸附NC膜差不多，所以关于流动封闭其实有一种作用很多人都不知道。MJ:不是为了防止搞基么？还有什么作用？T：我们封闭样品垫，比如我们在样品垫上加酪蛋白或者BSA，其实有个很重要的作用是封闭样品垫上的活性位点，比如玻纤上的活性位点。如果我们不封闭样品垫，检测肌钙蛋白I，肌钙蛋白是一种很容易吸附在玻纤上面的蛋白质，这样检测结果会偏低，所以，有