基于sbasa方法的近交系小鼠snp数据库的构建

基于sbasa方法的近交系小鼠snp数据库的构建

自jenon在上个世纪第一次应用封闭繁殖的小鼠系列以来，几乎没有成功转移到肿瘤（尤其是肿瘤）动物的医学研究以来，近交系实验动物（尤其是肿瘤研究）具有潜在的价值。尔后,关于培育近交系动物的理论及实践工作得到了较快的发展。高度近交系实验动物能为生物学、医学及农业科研工作提供敏感、特异性强和重复性好的试验材料。目前,已培育出了大量的小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、鸡等实验动物的近交系。在我国,随着生物科学的发展,培育大量的、具有各种特殊用途的、符合遗传质量标准近交系实验动物,满足科学研究的需要,已经刻不容缓。对于近交系小鼠,在从国外不断引进的同时,我国也先后培育出一些具有一定特征的品系,并逐步应用于各个科学领域。近交系小鼠具有同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善等特点,随着生命科学的不断发展,对其遗传品质要求越来越高。传统的小鼠遗传检测方法有形态学方法、免疫学方法、生物化学方法。随着一系列分子遗传标记的发现,产生了分子生物学检测方法,应用于实验动物遗传检测,如基于限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、随机引物多态性(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、微卫星(Microsatellite)和DNA指纹(DNAFingerprints)等。近来单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)技术也被用于近交系小鼠遗传质量检测,并建立了近交系小鼠的SNP数据库;但目前国内主要采用皮肤移植法和生化标志基因检测方法,因此国内培育的近交系小鼠的遗传背景也只是生化标志基因方面。我们最近建立了单管双向等位基因专一性扩增(single_tubebi_directionalallelespecificamplification,SB_ASA)方法,用于检测SNP位点,本文旨在用SB_ASA方法检测国内近交系小鼠,确定SNP位点等位基因型,从而为国内近交系小鼠的SNP数据库填补空白。1材料和方法1.1制备近交系小鼠dna采用酚:氯仿抽提法从鼠尾中提取了NCPC/2、NCPC/4、TA1、615等4个近交系小鼠品系DNA,所有品系均引自北京国家啮齿类实验动物种子中心,经遗传生化位点检测为合格的近交系小鼠。1.2pcr和vectors试剂DNA片段纯化试剂盒、限制型内切酶EcoRI、DNA聚合酶等PCR试剂购自宝生物公司(大连),pGEM_TEasyVectorSystem购自Promega公司。1.3cu-p3小鼠snp位点等位基因型的构建针对每个SNP位点,设计4个引物P1、MSP1、MSP2和P2进行PCR扩增,P1和MSP2、MSP1和P2分别扩出长度相差100bp以上的特征片段,而P1和P2在所有品系小鼠中扩增出一条可作为内对照的长片段。根据特征片段长度的差异,我们可以很容易地判断出各品系小鼠的SNP位点等位基因型。我们已经成功地建立了25μLPCR反应体系及其程序,PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果在紫外灯下照相记录,用生物电泳成像系统分析,根据凝胶上电泳条带判断SNP类型。1.4gemt价值用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片段,然后连接于pGEM_TEasyVector,转化DH5α感受态细胞,涂布在有氨苄抗性的固体培养基中,过夜培养,挑单克隆摇菌过夜培养,提取质粒,EcoRⅠ酶切验证,菌液送大连宝生物公司测序。2结果2.1利用加标回波加加低速率降解snp对16个SNP位点进行了检测,虽然某些位点引物二聚体、错配杂带现象仍存在,但是不影响SNP检测结果。通过琼脂糖凝胶电泳图谱(图1)可以看出,每个位点都扩增出3条目的片段,即一条所有品系都有的片段,由引物P1、P2扩增而得,起内对照的作用;两条特征片段,分别对应于不同的等位基因,根据特征片段的差异,可以很容易地确定每个品系的SNP位点等位基因。通过对多个SNP位点的检测,可以建立每个小鼠品系的SNP位点等位基因图谱,为各小鼠品系的遗传鉴定和品系间的鉴别提供了有利的实验数据,从而为近交系小鼠遗传检测提供了更加准确的遗传背景资料,表1为本实验检测的4个近交系小鼠16个SNP位点的等位基因型。2.2确定snp位点等位基因型根据电泳图中特征片段长度的差异,我们成功地对4个近交系小鼠16个SNP位点进行了检测,确定了SNP位点等位基因型;同时我们对其中的每条特征片段都进行了测序验证,测序结果显示其SNP等位基因型与SB_ASA方法检测的结果完全一致,说明了SB_ASA方法的可靠性,同时确定了SNP位点等位基因型。3新品系小鼠snp的检测位点对单管双向等位基因专一性扩增(SB_ASA)检测近交系小鼠SNP的可靠性我们作了考察。通过对5个国外近交系小鼠的16个SNP位点检测,结果其SNP位点等位基因均与国外报道的SNP数据库一致,通过测序也得到了验证,而且双盲实验通过3个SNP位点准确地把5个品系相互区别。本实验对近交系小鼠的16个SNP位点进行了检测,基本达到了国内外遗传检测要求,但作为新品系的鉴定及科学研究,还需进一步检测更多的SNP位点,以便提供更准确的实验动物遗传概貌。目前国内已经培育了一系列新品系近交系小鼠,本实验只检测了其中的4个品系,对于建立国内近交系小鼠SNP数据库而言显然不够,我们还需要对更多的国内品系小鼠进行检测,以备建立较完善的SNP数据资料。目前国际所规定的遗传检测方法是生化标记分析法,这一方法是检测同工酶或异构蛋白酶的变化来推测相应的基因变化,存在着准确度及灵敏度低,检测位点及反映遗传概貌有限等弊端。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,具有密度高、代表性、遗传稳定性