两亲性星型端氨基peg-plga纳米胶束的制备及体外细胞毒性

两亲性星型端氨基peg-plga纳米胶束的制备及体外细胞毒性

近年来，可生物降解的高大挺拔的聚合物被广泛用作药物载体。聚乳液酸聚乙醇酸（plga）具有良好的生物适应性和抗生物降解性，已成为常用的药物载体之一。然而，plga的直接结构允许在用作药物载体时引入大量的功能基地，并且很难限制材料的广泛应用。为了解决这个问题，多臂星聚合物的出现为解决这一问题，决定了另一个方向。这种聚合物的结构通常是规则的。分子体积可以精确地控制，颗粒的分布可以达到单分散性，并且可以配置更多的组件。在相同体积的小水流中，星聚合物的分解率可以迅速提高，有利于药物的负荷和传输。脂溶性可生物降解聚合物用作药物载体时,在体内易被网状内皮系统识别吞噬,从而阻止药物到达靶向部位,降低了药物的生物利用度.亲水性PEG链段的引入可以显著地提高药物的生物利用度,PEG具有优异的生物相容性,在体内能溶于组织液,分子量4000以下的PEG能被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用,其安全性已经得到了美国食品和药物管理局(FDA)的认证.将PEG进行双末端改性可以引入官能性基团氨基,使用化学方法将脂溶性材料与双端氨基PEG反应可以得到两亲性聚合物.PEG的引入不仅能够改善脂溶性材料的亲水性,还能赋予材料新的特性和功能:减少生物体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的黏附,有效调控载体的亲疏水性和药物释放速率,避免被网状内皮系统识别吞噬,从而延长药物在血液中的循环时间.同时,由于引入了官能性基团氨基,可以使材料更有效地结合靶向配体或靶分子来增强药物的的靶向治疗作用.本文设计合成了六臂星型PLGA,通过N-环己基碳二亚胺(DCC)缩合法引入H2N-PEG-NH2得到新型两亲性聚合物6-s-PLGAx-PEG-NH2,考察了材料的自组装性能,研究了聚合物纳米胶束对兔主动脉平滑肌细胞(SMC)的体外细胞毒性作用.1实验部分1.1精细化工所需资源乙交酯,m.p.83.5～85.5℃,北京元生融科技有限公司;DL-丙交酯,m.p.126.5～127.5℃,北京元生融科技有限公司;肌醇,天津市光复精细化工研究所;聚乙二醇4000(PEG4000),天津市光复精细化工研究所;丁二酸酐,分析纯,天津市光复精细化工研究所;4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺和N-环己基碳二亚胺,纯度99%,上海共价化学公司;四氢呋喃,色谱纯,天津市康科德科技有限公司;二氯甲烷、无水乙醚和甲醇等溶剂均为市售分析纯试剂.Malvernnano-ZS型纳米激光粒度仪,英国Malvern公司;Waters510型凝胶排阻色谱仪(GPC),美国Waters公司;JEOLJEM1010型透射电子显微镜(TEM),日本JEOL电子株式会社;400MHz核磁共振氢谱仪(1HNMR),美国Varian公司.Q2000型差示热量热分析仪(DSC),美国TA公司.ZetasizerNano-ZS型动态光散射分析仪(DLS),英国Malvern公司.1.2由两亲性六臂星组成的氨基peg-plga合成1.2.1聚合物的合成以乙交酯和丙交酯为原料,肌醇为引发剂,辛酸亚锡为催化剂,在N2气保护下,采用开环聚合法在160℃反应8h,得到3种引发剂与单体比例不同的六臂星型PLGA,材料配比参见表1.合成路线参见Scheme1.将产物用二氯甲烷溶解完全,加入无水甲醇进行沉淀,弃去上清液,反复3次得白色黏稠状产物,50℃真空干燥至恒重.用1HNMR测定聚合物的结构;用GPC测定聚合物的分子量分布情况,样品浓度为2.5～5mg/mL,流动相为色谱纯的THF,流速为1mL/min,以聚苯乙烯(PS)为标准品,用示差折光检测器检测;用DSC测定聚合物的玻璃化转变温度(Tg),取5～10mg样品,在N2气氛(50mL/min)中,以5.0℃/min的升温速率从-20℃升温至60℃.1.2.2以4-二甲氨基吡啶dmap为原料的路线分别称取3种不同配比的6-s-PLGA各0.1mmol溶于20mL干燥处理过的1,4-二氧六环中,同时各加入丁二酸酐(0.072g,0.72mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.073g,0.6mmol),在N2气保护下电磁搅拌过夜,合成路线见Scheme1.反应26h后,用旋转蒸发仪除去多余的溶剂,将浓缩液滴入过量的冷无水乙醚中得白色黏稠物,将白色黏稠物溶于30mL二氯甲烷中,分别用体积分数为10%的盐酸(30mL×3)和饱和食盐水(30mL×3)洗涤.有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,将滤液滴入过量的冷无水乙醚中,得白色黏稠状产物,于40℃真空干燥至恒重,收率为91%.1.2.3聚乙二醇sto-peg-ots的合成称取PEG4000(20g,5mmol)溶于100mLCH2Cl2中,加入对甲苯磺酰氯(TsCl)(3.81g,20mmol),搅拌状态下加入28mL三乙胺,室温反应12h.反应结束后,用1mol/L盐酸萃取,向有机相中加入过量的无水碳酸钠和无水硫酸镁,充分搅拌,过滤,浓缩滤液,将浓缩后的滤液滴入过量的冷无水乙醚中,得到白色沉淀.40℃真空干燥至恒重,得白色化合物对甲苯磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs).在N2气保护下,将对甲苯磺酰化的PEG溶于40mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),于40℃电磁搅拌下逐滴加入到乙二胺溶液中反应24h.合成路线见Scheme2.反应结束后,将乙二胺减压蒸馏,得少量浓缩液,将浓缩液滴入冷的无水乙醚中沉淀,所得产物再用冷无水乙醚洗涤2～3次,于40℃真空干燥至恒重,即得双端氨基聚乙二醇,收率为87%.测定红外光谱,用元素分析法测定末端氨基化的转化效率.1.2.4-s-plga200-peg-nh2的合成采用DCC缩合方法合成6-s-PLGAx-PEG-NH2,以6-s-PLGA100-PEG-NH2为例.称取羧基封端的6-s-PLGA100(0.1mmol)溶于20mL二氯甲烷中,分别加入羧基活化剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.6mmol\,N-环己基碳二亚胺(DCC)0.6mmol和4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.6mmol.该反应在磁力搅拌和氮气保护下,室温反应24h,反应结束后过滤除去沉淀析出的二环己脲(DCU),再用冷的甲醇和乙醚的混合溶剂进行沉淀,并洗涤2～3次,产物于40℃真空干燥至恒重.将上一步的产物溶于20mL二氯甲烷中,在N2气保护下逐滴加入到含有过量的端氨基聚乙二醇(7.2g,1.8mmol)的二氯甲烷溶液中,在磁力搅拌和N2气保护下室温反应48h.反应结束后,抽滤除去不溶物,将滤液滴入过量的冰无水乙醚中,得到白色黏稠状产物,再用冰甲醇洗涤2～3次除去过量的端氨基PEG,产物于室温真空干燥24h得两亲性6-s-PLGA100-PEG-NH2,收率为67%.合成路线见Scheme3.1.3纳米粒子的表征以6-s-PLGA100-NH2为例.称取100mg6-s-PLGA100-NH2,溶于2mL丙酮溶液中,电磁搅拌下将该溶液逐滴滴入到50mL水中,用透析袋透析除去有机溶剂,得到纳米粒子,冷冻干燥备用.取冻干样品分别溶于D2O和CDCl3中,用1HNMR验证聚合物的胶束结构.取少量纳米粒子用水复溶制成质量分数为0.5%的溶液,超声溶解后用DLS测定其粒径大小及分布情况,并用TEM测定粒子表面形态与粒径大小.1.4mtt法检测细胞生长曲线用含有100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素和10%(体积分数)胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养兔主动脉平滑肌细胞(SMC).取处于对数生长期、生长状况良好的SMC,用0.25%(质量分数)的胰蛋白酶消化细胞,离心沉淀细胞,用含10%FBS的DMEM-F12培养液配成单个细胞悬液,细胞密度为3×104Cell/mL,以每孔3×103Cell接种于96孔培养板中(设4个复孔),每孔100μL,在37℃,5%CO2及饱和湿度条件下培养.实验分4组,空白对照组(不加细胞)\,阴性对照组(加细胞不加样品)\,阳性对照组(PLGA空白纳米粒子,终浓度为665μg/mL,制备方法参见文献)和实验组(6-s-PLGA100-PEG-NH2纳米粒子,加入100μL各组样品液使终浓度分别为3.29,13.15,52.65,210.63和842.5μg/mL).待细胞贴壁后,每孔加入100μL配制好的各组溶液.分别培养24,48,72,96,120h,然后每孔加入20μL用磷酸盐缓冲溶液(PBS)新鲜配制的MTT溶液(5mg/mL),继续孵育4h,弃去培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解后采用酶联免疫检测仪测定每孔的OD490,测定5个时间段的OD490,将每组测定结果用空白组校正后绘制细胞生长曲线.2结果与讨论2.16氨基氢信号峰的确定图1谱线a和b分别为6-s-PLGA100-PEG-NH2和6-s-PLGA100的1HNMR谱图,对照品为四甲基硅烷(TMS).在6-s-PLGA100链段中(谱线a),δ1.569是DLA中CH3氢的信号峰,δ5.158和4.810分别是DLA的CH氢的信号峰和GA的CH2氢的信号峰.对质子峰面积进行积分,峰面积比约为3∶2,即DLA中的CH氢与GA中的CH2中氢的数量比为3∶2,即DLA与GA占聚合物的比例为3∶1.与投料时丙交酯和乙交酯的比例一致,证明聚合物PLGA的嵌段结构的摩尔比为75∶25.图1谱线a中未见其它峰的存在,证明聚合物纯净.谱线b中,除了与谱线a相对应的信号峰外,增加了δ3.636处的吸收峰,为PEG链中CH2的信号峰.证明双端氨基的PEG已经成功地接到多臂PLGA分子链的末端.由于氨基在整个共聚物链段中所占的比例很小,所以氨基氢的信号峰未明显地表现出来.2.26引发剂为100和6-s-plga200的分子量表2为3组6-s-PLGAx与6-s-PLGAx-PEG-NH2的GPC测得的分子量分布数据.对于6-s-PLGAx聚合物,其分子量分散指数均在1.2左右,呈明显的单分散状态.6-s-PLGA50,6-s-PLGA100和6-s-PLGA200分子量分别为8700,17000,34000,分子量的比值接近1∶2∶4,与投料时单体与引发剂的比值保持一致.这也说明引发剂的量直接影响聚合物的分子量大小,可以通过控制引发剂的加入量控制聚合物的分子量.对于两亲性嵌段共聚物而言,其分子量基本接近于相应的聚合物分子量与六条臂上聚乙二醇的分子量之和.这也进一步证实了聚合物的六臂结构.另外,测定分子量时由于以直链聚苯乙烯为标准样品,对于多臂聚合物分子量的测定会有一定的误差.但是目前没有测定支链结构的标准品,因此本研究采用了直链聚苯乙烯为标准样品作为分子量测定时的参考.对于两亲性嵌段材料,由于PEG链段在THF中的伸展性不是很好,测得的结果存在的误差稍大.2.3eg对6-plgax-peg-nh2和6-s-plgax-peg-nh2的tg分析不同聚合物的玻璃化转变温度(Tg)数据也列于表2中.由表2可知,对于6-s-PLGAx,分子量越大,Tg越高,这可能是因为随着分子量的增大,空间位阻也相应增大,造成结构上的拥挤或者端基带有更多的自由体积,使分子有着更大的运动自由度,即端基效应而导致其Tg升高.6-s-PLGAx-PEG-NH2和6-s-PLGAx相比,由于PEG的加入,链的柔顺性增强,而柔顺性越好,Tg越低,因此6-s-PLGAx-PEG-NH2的Tg明显低于6-s-PLGAx.比较3组6-s-PLGAx-PEG-NH2发现,Tg随着PEG含量的减少而逐渐增大,与共聚物的单臂臂长关系不大.2.4苯环的不对称伸图2为PEG,sTO-PEG-OTs和H2N-PEG-NH2的红外吸收光谱图.图2谱线b中2883,1467和839cm-1分别为C—H的伸缩振动、弯曲振动和摇摆振动的特征吸收峰;在1114cm-1处为C—O—C的不对称伸缩振动;与图2谱线a相比,在1597cm-1处的吸收为SO2中SO的对称伸缩振动,776cm-1为苯环的面内弯曲振动;664cm-1处为SO2中S—O单键伸缩振动.可以看出,聚乙二醇的端羟基己经与对甲苯磺酰氯发生反应,形成了sTO-PEG-OTs.在图2谱线c中,3329cm-1处为伯胺—NH2的N—H伸缩振动特征峰,1638cm-1处的为NH2的N—H键的弯曲振动,1597和776cm-1处的吸收峰消失,表明化合物sTO-PEG-OTs已经成功胺解,生成了H2N-PEG-NH2.用元素分析法测定了H2N-PEG-NH2的末端氨基含量,计算出双末端氨基转化率为91.68%,表明该备方法具有很强的实用价值.2.5胶束形成“壳”的研究在制备空白纳米胶束的实验中,丙酮为两嵌段共聚物的共溶剂,而水为PEG-NH2嵌段的良溶剂,PLGA嵌段的沉淀剂.在合适的条件下,PLGA嵌段的分子链相互缠结在一起形成胶束的“核”,而溶于水的PEG-NH2嵌段形成胶束的“壳”.对制得的纳米粒子,采用DLS测得纳米粒子的平均直径为39.98nm,PDI值为0.18,呈现良好的