QPCR常见问题及解决方法

QPCR常见问题及其分析解决办法\o"分享到微信"\o"分享到QQ好友"\o"分享到新浪微博"\o"分享到QQ空间"普通来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就能够。由于real-timeqPCR敏捷度高，因此每个样品最少要做3个平行孔，以防在背面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。普通来讲，反映体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA普通是10ng-500，如果cDNA，普通状况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的体现丰度进行调节。固然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达成一种最佳反映体系。在反映体系配备过程中，有下面几点需要注意：1.MasterMix不要重复冻融，如果经常使用，最佳溶解后放在4度。2.更多的配制Mix进行，减少加样误差。最佳能在冰上操作。3.每管或每孔都要换新枪头！不要持续用同一种枪头加样！4.全部成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品最少3个平行孔。参比或者校正染料（referencedye，passivedye）惯用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其它染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就能够。参比染料的作用是原则化荧光定量反映中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一种稳定的基线。现在诸多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反映曲线良好或已经优化好反映体系，也能够不加ROXTM染料校正。普通来讲，real-timeqPCR的反映程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，因此只需要变性和退火就能够了。SYBR@Green等染料法，最佳在PCR扩增程序结束后，加一种溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设立，或稍有不同，但都是一种在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。3.仪器设立全部仪器的操作都基本一致。设立的时候涉及反映板设立（platesetup）和程序设立（programsetup）。我们以ABIStepOne为例，具体看一下反映设立：A.首先是实验目的选择：定量还是其它。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B.实验办法的选择：我们选用的比较Ct的SYBRGreen办法，Fast程序，以cDNA为模板进行。C.目的基因的设立：有几个目的基因和目的基因的名称。D.样品的设立：涉及哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设立和生物重复的设立。E.对照组和内参基因的设立：这个是为背面的定量做准备F.反映程序的设立：PCR反映程序的设立要根据不同公司的MasterMix。例如BioTeke的95℃2分钟就能够激活DNA聚合酶（ABI的需要10分钟）。循环反映是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设立就能够。或者是仪器阐明书上建议的程序。G.反映体系的设立：A-G这五个环节简朴设立好，能够保存，修改反映程序或者立刻进行反映。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其它染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一种环节的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，因此选择“none”。设立好之后，就能够把配备好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-timeqPCR数据分析1.Real-timeqPCR常见参数基线（baseline）普通是3-15个循环的荧光信号同一次反映中针对不同的基因需单独设立基线阈值（threshold）自动设立是3-15个循环的荧光信号的原则偏差的10倍手动设立：置于指数扩增期，刚好能够清晰地看到荧光信号明显增强。同一次反映中针对不同的基因可单独设立阈值，但对于同一种基因扩增一定要用同一种阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候普通取Ct:15-35。太大或者太小都会造成定量的不精确。Rn（Normalizedreporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的原则化成果（△Rn=Rn-基线）。2.影响Ct值的核心因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最重要因素。控制在一种适宜范畴内，使Ct在15-35之间。反映液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响例如溶液的pH值和盐浓度。PCR反映的效率PCR反映的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行持续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的原则曲线。PCR效率取决于实验、反映混合液性能和样品质量。普通说来，反映效率在90-110%之间都是能够接受的。3.如何评定实时定量PCR反映的效果PCR扩增效率：为了对的地评定PCR扩增效率，最少需要做3次平行重复，最少做5个数量级倍数(5logs)持续梯度稀释模板浓度。常见问题1.无Ct值出现检测荧光信号的环节有误:普通SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则普通在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量局限性:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及重复冻融的状况。2.Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低:反映条件不够优化。设计更加好的引物或探针；改用三步法进行反映；适宜减少退火温度；增加镁离子浓度等。PCR多个反映成分的降解或加样量的局限性。PCR产物太长:普通采用80-150bp的产物长度。3.原则曲线线性关系不佳加样存在误差:使得原则品不呈梯度。原则品出现降解:应避免原则品重复冻融，或重新制备并稀释原则品。引物或探针不佳:重新设计更加好的引物和探针。模板中存在克制物，或模板浓度过高4.负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹构造的出现。引物浓度不佳：适宜减少引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适宜减少镁离子浓度，或选择更适宜的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5.溶解曲线不止一种主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹构造的出现。引物浓度不佳：适宜减少引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适宜减少镁离子浓度，或选择更适宜的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6.扩增效率低反映试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反映条件不够优化：可适宜减少退火温度或改为三步扩增法。反映体系中有PCR反映克制物：普通是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反映体系中，减少克制物的影响。7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断原则：扩增效率，敏捷度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都能够把数据用于分析。8.扩增曲线的异常？例如“S”型曲线？参比染料设定不对的(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解荧光定量PCR问题汇总1.定量PCR仪的开关机次序是如何的？按照对的的开关机次序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机次序：先开电脑，待电脑完全启动后再启动定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机次序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2.哪些种类的反映管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验能够使用下列耗材：96孔光学反映板配合光学膜，0.2ml光学八联反映管配合光学膜，0.2ml光学八联反映管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用办法和货号见下表：3.为什么要定时对电脑进行磁盘碎片整顿？如何整顿？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验成果时，计算机会删除并创立若干文献，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文献以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才干存取文献，由于必须多次寻找文献碎片以存取不同的片断。碎片整顿实用程序将一种文献分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一种位置，从而去除文献碎片，进而优化系统性能。碎片整顿的办法以下：·在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(Mycomputer)。·在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。·在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整顿(Defragmentnow)。·单击碎片整顿(Defragment)。·当显示“碎片整顿完毕”对话框时，单击（拟定）。·在“本地磁盘属性”对话框中，单击（拟定）。·为计算机机中剩余的驱动器重复如上环节。4.何时执行windowsservicepack更新？不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表告知您更新操作系统，否则请不要更新控制订量PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWindows操作系统有可能与SDS软件存在冲突，并造成仪器不能正常运行。如果您但愿安装servicepack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS软件提供的版本阐明，避免兼容性问题。5.应当备份哪些数据？应当定时备份您的实验数据，备份频率推荐每七天一次，用光盘刻录。同时您也应当备份定量PCR仪的多个纯荧光光谱校正文献、背景文献和安装验证明验数据，这些文献所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDSDocument。下图是校正文献的样本。6.怎么样的实验室环境才干确保仪器设备正常运行？良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到下列几个方面：电源：推荐配备适宜的UPS或稳压器。通风：仪器的通风应当没有阻挡。温度：推荐实验室配备空调，温度应当控制在10-30°C之间。湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。7.如何判断定量pcr仪的样本加热块与否被污染？如何去除污染？一种方法是运行背景校正反映板，当一种或多个反映孔持续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。另外一种方法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其它孔时，则表明该孔被污染。去除样本加热块污染的环节以下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反映孔中。吹打多次。将废液吸入废液杯中。重复以上环节：乙醇三次，去离子水三次。确认反映孔中的残留液体蒸发完。8.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反映管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内持续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随即，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取成果并保存到校正文献中。软件在此后的分析中将自动调用此校正文献，从实验数据中扣除背景信号。由于背景荧光的信号强度随着许多外界因素（例如外来的污染、反映板/反映管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，因此推荐定时进行背景校正，普通每三个月到六个月校正一次。9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？纯荧光校正是测定多个纯荧光染料原则品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”多个荧光染料。软件收集并储存多个纯荧光染料原则品的荧光信息。后来每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文献中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而拟定样品中的荧光染料种类和信号强度。推荐每六个月进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板如何封膜？当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜替代盖子来密封反映孔。对的的封膜办法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边沿按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应当如何安排放置？使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最佳是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后逐步向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反映管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12.绝对定量与相对定量有什么区别？绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即普通所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要懂得它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中涉及解决过的和未经解决的对照样本，普通能够将未经解决的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经解决的样本的定量成果除以对照样品的定量成果，就能够计算各个解决样本的基因含量相对于未解决样品的比例。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对原则品，必须做原则曲线。相对定量能够做原则曲线，也能够不做原则曲线。相对定量实验有两种办法：原则曲线法和CT值比较法。如果使用原则曲线法，能够使用绝对原则品，也能够使用相对原则品，并且相对原则品在实验操作上更为简便易行。相对原则品是只懂得样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要懂得其分子数目的原则品，典型的做法是将一种已知pg数的样品做一系列梯度稀释。CT值比较法是运用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对比例，其计算公式是。绝对定量的数据易于理解，但是绝对原则品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的原则品试剂盒供选购，能够解决这种困难。相对定量的原则品容易在实验室里自己制备，但是数据解决比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13.定量PCR基因体现的实验数据应当如何解决？总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反映总体积的差别、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差别、管盖透光性能的差别等所引发的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改善定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。另首先，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，因此将实验成果校正到每个细胞的含量是必要的。办法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一种内对照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据能够互相比较。第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。例如研究解决和未解决的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因体现的差别，则需要计算解决/未解决、6小时/0小时、患病/正常。14.原则曲线法相对定量的数据应当怎么解决？假设实验的目的是研究药品解决后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的体现量的变化，所用的内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定成果都是总RNA的pg数，数据的解决办法见下表：15.什么是CT值比较法？数据怎么解决？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：如果(1)不同管之间的PCR反映效率相似；(2)这些PCR的反映效率靠近100%，能够从上面的公式推出相对含量(X01/X02)=2-δδCT。假设实验的目的是研究药品解决后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的体现量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定成果都是CT值，而没有通过原则曲线测定总RNA的pg数。16.每个反映管中能够加入多少种探针？每个反映管中能够加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量事实上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或变化滤色片。改动仪器的构造普通很困难。以AB公司的仪器为例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。另首先是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反映管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既确保信号激发的效率又确保信号不重叠干扰，能够分辨清晰。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。现在的最佳组合只能达成每组4到5种荧光的水平。第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩余2种荧光能够标记探针，对于5色检测的仪器尚有3种荧光能够使用。如果将探针改用TaqManMGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就能够多1种荧光用于标记探针。如果实验规定不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样做），还能够再多一种荧光用于标记探针。第四是研究应用本身的规定。如果研究SNP和基因突变，由于绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基