双向电泳步骤-标准操作完整版_第1页
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文档简介

双向电泳双向电泳■sun■sun#~一SDS：使蛋白变性并形成带负电荷的蛋白-SDS复合物。DTT：在胶条平衡中的目的是打断二硫键，使变性的非烷基化蛋白处于还原状态。IAA:通过烷基化反应，使蛋白质硫醇基团烷基化，在电泳过程中防止蛋白再氧化，封闭打断的二硫键的部位，使其不能相互连接。在电泳过程中蛋白质的再氧化会产生拖尾或其他假象，同时可以使残留的DTT烷基化，从而防止点拖尾或其他银染假象。染色一、银染：银染试剂：（每块胶）250mL固定液：乙酸乙醇纯水乙酸乙醇纯水2.敏化液：10%100mL乙醇75mL乙醇75mL硫代硫酸钠（NaSO）223乙酸钠纯水3.染色液：硝酸银纯水0.79g10.25g175mL0.25%0.625g250mLTOC\o"1-5"\h\z甲醛（临用前加入）100uL20min显色液碳酸钠2.5%6.25g纯水250mL甲醛（临用前加入）100uL终止液：

3.65g乙二胺四乙酸二钠1.46%3.65g纯水250mL实验步骤：银染步骤：1固定：使用固定液固定双向电泳胶，固定时间大于1小时，过夜也可。敏化：倒掉固定液，加入敏化液，敏化半小时。水洗：倒掉敏化液，加入纯水，水洗时每隔十分钟更换一次纯水，冲洗四次。银染：避光，加入银染液，银染30分钟。倒掉银染液，纯水冲洗胶，洗掉附着在胶面和盒子上的硝酸银。显色：加入显色液后，溶液变黄，置于摇床观察显色情况。保证显色效果一致，显色保证底色不要太深。终止：当胶上点全部显出后，倒掉显色液，加入终止液。迅速终止反应，并终止10分钟。使用纯水冲洗胶面，适当去除胶面的银颗粒，准备扫胶。二、考马斯亮蓝染色考染试剂：染色液（200mL）：考马斯亮蓝R250乙醇0.1%0.2g50%100mL乙酸5%10mL纯水90mL脱色液（可直接使用纯水）冰乙酸7.5%75mL甲醇5%50mL水87.5%875mL蛋白来源差异：细菌蛋白：高核酸蛋白比，核酸去除占重要地位。真菌蛋白：有较厚的细胞壁，使用较强的裂解剂，比如活性高的破壁酶以及SDS等。细胞：培养基中盐分较多，使用蔗糖缓冲液(washingbuffer)冲洗植物组织细胞：

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