实验一-植物细胞有丝分裂及染色体行为的观察

遗传学实验指导教师：刘振兰

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生命科学学院北楼607室显微镜使用注意事项每次使用之后要登记（登记本在显微镜下的抽屉里,请注意你使用的显微镜后面的编号和记录本上面的编号要一致）；使用完后请把载物台按逆时针方向调到最低位置,4X物镜放到光路中间，并将电压调至最小；不要拖动显微镜，如需调整位置请搬动显微镜的底部抬起移动；请不要使用100X油镜去观察样品!!!显微镜是贵重仪器,请大家小心爱护使用。谢谢!遗传学是一门实验性的学科。它的每一步发展都是以实验作为基础的。因而实验教学是教学中非常重要的组成部分。通过实验课我们要学习什么？遗传学基础实验方法的训练和基本规律的验证－基本技能的训练；实验设计能力和科学研究素质的培养；强调理论与实践相结合，培养和锻炼学生用所学知识解决实际问题的能力。参考书目《遗传学分析实验教程》乔守怡主编，高等教育出版社2008年1月第一版；《遗传学综合实验》李雅轩、赵昕主编，科学出版社2006年5月第一版；《遗传学实验技术》卢龙斗、常重杰主编，科学出版社2007年9月第一版；《遗传学综合实验》刘祖洞、江绍慧编，高等教育出版社1987年11月第二版。课程评价成绩主要由课程考勤、上课表现和实验报告三部分组成。请认真独立的完成实验报告，严禁抄袭及杜撰实验数据！请用华南农业大学实验报告纸；实验报告的内容：实验目的实验原理主要试剂及材料实验步骤实验结果与分析（请用铅笔绘图）作业及思考题当节课的实验报告下次课交上来。实验报告的要求植物遗传学系列动物及医学遗传学系列微生物遗传学系列果蝇遗传学系列数量与群体遗传学系列分子遗传学系列遗传学实验的内容植物细胞有丝分裂及染色体行为的观察（316）植物细胞减数分裂及染色体行为的观察（316）果蝇的饲养及形态观察（324）果蝇的有性杂交（设计性实验）（324）植物有性杂交技术（田间试验）辐射诱变对染色体结构的影响（316）人工诱发多倍体植物（316）大肠杆菌乳糖操纵子基因的表达调控（324）实验一植物细胞有丝分裂及染色体行为的观察有丝分裂中的纺锤体

一、实验目的学习和掌握植物染色体压片法；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化，识别有丝分裂的不同时期。二、实验原理动植物的许多组织细胞都进行有丝分裂。高等植物的根尖和茎端分生组织，高等动物的骨髓和一些上皮组织，都是观察有丝分裂现象的适宜部位。由于各个细胞的分裂是独立进行的，因此在同一组织中可以看到不同分裂时期的细胞。通过观察各个时期内染色体（或染色质）的存在状态，就可以判断这些细胞各处于有丝分裂的哪个时期，进而认识有丝分裂的完整过程。通过有丝分裂和细胞分化，DNA准确地在细胞世代间相传，实现组织发生和个体发育。

三、实验步骤取材固定解离染色压片操作镜检

1.取材

本实验以洋葱为材料，在室内(25度)培养根尖。用广口瓶装满水，把洋葱放在瓶口上，使洋葱的鳞茎盘与水充分接触，每天换水促进生长，生根前去掉洋葱外面干燥膜状鳞叶，以免污染瓶水，抑制生根。

不定根1.5-2cm时取材固定或进行预处理。洋葱根尖细胞以上午6-9时为分裂高峰期。根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料。根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姐妹染色单体交换的基础。2.固定

采用渗透力强的固定液将植物组织、细胞迅速杀死，使蛋白质沉淀，使植物材料保持原有状态。固定方法：将植物材料用蒸馏水冲洗2次→转移到卡诺氏固定液中→固定3～24h。固定后的材料可以转入70%乙醇溶液中,在4度冰箱中保存，但保存时间最好不超过2个月。固定的目的：迅速防止细胞死亡后的变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构；使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持活体的形态；使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定；使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色；防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。3.解离常用酸解法和酶解法；酸解法：固定后的材料用清水冲洗，放入1mol/L的HCl中60℃处理5～10min。注意：掌握好温度和时间，若解离时间不够，则压片不易分散；解离时间过长，下一步处理时由于材料过软而易将根尖丢失。解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解,细胞壁软化或部分分解,使细胞和染色体容易分散压平。酸解优点：制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片。缺点：染色体较软，容易缠绕，不易分散；对小型染色体的材料效果较差。注意：酸解是本实验成败的关键之一。酸解温度应保持在60（上下浮动不超过0.5度），如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，游离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。4.染色解离后的材料用蒸馏水冲洗，将根冠和伸长区切除，只留分生区部分→将根尖置于载玻片上，加一滴染色液，5～10min。5.压片操作盖上盖玻片，在酒精灯火焰上过3～4次，以手背感觉玻片微烫为宜。此步骤是使材料更易软化和着色，并破坏部分细胞质使染色背景清晰。若室内气温较高或认为染色效果较好，也可省去此步骤。用左手拇指压住盖玻片的一角，右手拿铅笔（橡皮头朝下）垂直敲盖玻片几下，将材料震散。注意用力均匀，确保两玻片不错动，将材料压成薄薄一层，即可放在显微镜下观察。6.镜检压好的片先在低倍镜下镜检，找到分裂细胞后，再转换成高倍镜观察染色体动态变化。如果染色体分散良好，图像清晰，可以进行显微照相保存。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻敲打盖玻片，分生组织细胞就可以铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相。注意事项压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地；解离时间不可过长，以免染色体结构受损；解离后水洗要彻底，否则不易着色；用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，会使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相细胞；防止出气泡。作业及思考题绘出在显微镜下观察到的有丝分裂各时期的示意图。为了便于观察有丝分裂的过程及其中染色体的动态变化，最好应该选择什么样的材料，为什么？你观察到的洋葱染色体有丝分裂以什么时期为最多？染色体和染色质互变、染色体加倍各发生在什么时期？醋酸洋红将洋红粉末1g倒入100mL45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸(沸腾时间不超过30s)，然后悬入一生锈的小铁钉于染液中，过1min取出，或加入1%～2%铁明矾水溶液5-10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止。静置12h后，过滤于一棕色试剂瓶中，储存备用。配制方法：先配成三种原液,再配成染色液

原液A:3g碱性品红溶于100ml70%酒精中.

原液B:取原液A10ml加入到90ml5%石炭酸水溶液中.

原液C:.取原液B55ml,加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林(38%的甲醛).

(原液A和原液C可长期保存,原液B限两周内使用).

染色液:取C液10—20m1,加45%冰醋酸80～90ml,再加山梨醇1.8