mhc类分子反式激活因子突变体的构建及其抑制hladrdq表达的机制

mhc类分子反式激活因子突变体的构建及其抑制hladrdq表达的机制

mhs-u型激分子（c）ta）与mhs-u型基因的转移和形成密切相关。CⅡTA分子的N端约180个氨基酸区域具有强烈的反式激活作用;C端是富含亮氨酸的区域,通过反式作用蛋白,C端与MHC-Ⅱ基因启动子区的顺式作用元件结合,CⅡTA可实现其对MHC-Ⅱ类分子的表达调控。近年来,利用分子生物学手段去除CⅡTAN端反式激活区域,构建能抑制被转染细胞中MHC-Ⅱ类分子表达的CⅡTA突变体,是有关CⅡTA研究中的热点。一方面,希望找到简便实用的突变体构建方法;另一方面,人们希望实验证实突变体抑制MHC-Ⅱ类分子表达的机制。pUHD10-3是一种四环素剂量依赖的表达载体,在不同浓度的四环素作用下,pUHD10-3和连接在载体上的目的基因的表达可受到不同程度的抑制,他使得对导入基因的表达量进行调控成为可能。我们在成功地克隆CⅡTAcDNA的基础上,构建了CⅡTA突变体并引入载体pUHD10-3。构建能有效地抑制MHC-Ⅱ类分子的表达的CⅡTA突变体,并对其抑制机制进行了探讨。1材料和方法1.1菌株、质粒及试剂CⅡTAcDNA由上海市免疫研究所自行克隆并将其连接在载体pcDNA3上,构建成重组质粒pcDNA3/CⅡTA。Raji细胞、Hela细胞、DH5α菌株及质粒pcDNA3均为本所保存。EcoRI、EcoRV、XhoI及NotI等限制性内切酶由宝灵曼公司购得。PCR产物纯化试剂盒购自Qiagen公司。G418、lipofectamine脂质体转染试剂盒购自GibcoBRL公司。IFN-γ购自PEPROTECH公司。抗HLA-DR/DQ单抗(mAb)购自PharMingen公司。质粒抽提试剂盒购自Promega公司。各种引物和寡核苷酸链均由上海生工公司合成。1.2方法1.2.1pcr扩增条件根据文献,用NotⅠ和XhoⅠ酶切pcDNA3/CⅡTA,得到CⅡTA基因第1340～3390bp的片段,然后将其克隆到pcDNA3载体上。同时PCR扩增CⅡTA基因第567～1339bp的片段,上游引物为:5′-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-3′,含EcoRV酶切位点(画线部分);下游引物:5′-GCTCACTGCCCCAGCCCAATA-3′,PCR扩增条件:94℃1min,55℃1min,72℃1min,共33个循环。按试剂盒说明书,纯化PCR产物,将其插入上述含有CⅡTA第1340至3390bp片段的pcDNA3载体上,构建pcDNA3mCⅡTA2突变体,该突变体含有CⅡTA基因第567～3390bp这一片段,去除了CⅡTA分子N端的酸性激活区域。由于缺乏ATG起始密码,该基因突变体不能编码相应的蛋白。1.2.2和5-tagctoragagcaaccgattrtag3人工合成两条互补的寡核苷酸链,序列分别为:5′-AATTCTACACAATGCGTTGCCTGGCTCCA-3′和5′-TGGAGCCAGGCAACGCATTGTGTAG3′。有意义链中含ATG起始密码和1个EcoRⅠ酶切位点(如序列中划线部分),另一条链中含有1个平端,将两条寡核苷酸链于95℃变性,室温冷却3h,并将它们插入pcDNA3mCⅡTA2突变体的EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点之间,构建成pcDNA3mCⅡTA3突变体。1.2.3c-3和5-gaccctctctrt-3人工合成两条互补的寡核酸链,序列分别为:5′-AATTCTACACAATGCGTTGCCTGGCTCAAAGAAGAAGCGCAAGGTC-3′和5′-GACCTTGCGCTTCTTCTTTGGAGCCAGGCAACGCATTGTGTAG-3′。这两条寡核苷酸比1.2.2中的两条多了21个寡核苷酸,能够合成核转位信号肽(nuclearlocalizationsignal,NLS),使CⅡTA突变体更有效地进入细胞核。将两条寡核苷酸链插入pcDNA3mCⅡTA2突变体的EcoRⅠ和EcoRV酶切位点,构建成pcDNA3mCⅡTA4突变体。1.2.4细胞培养细胞转染用T7通用引物,将pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4两个突变体进行部分测序,确证上述两对寡核苷酸链已成功地联接在pcDNA3mCⅡTA2突变体上。将上述构建的pcDNA3mCⅡTA2、pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA43个突变体连同空载体pcDNA3,分别转染入Hela细胞和Raji细胞。转染方法按Gibco公司的产品说明。用含G418(500mg/L)的RPMI1640营养液筛选Hela细胞和Raji细胞,挑选出含上述3种突变体及空载体pcDNA3的细胞。1.2.5hla-dr/dq分子的表达收集Hela细胞、Raji细胞及转染上述突变体和空载体的Hela细胞和Raji细胞,用相应的mAb和流式细胞术,观察它们在IFN-γ(5×105U/L)刺激前后,HLA-DR/DQ分子的表达变化。1.2.6引物的基因扩增收集各种方法处理过的Hela细胞和Raji细胞,按常规方法抽提RNA,以RT-PCR检测内源/外源CⅡTA基因及HLA-DR基因的表达。用于扩增HLA-DR基因的引物,上游引物为5′-CGAGTTCTCTATCTGAATCCTG-3′,下游引物为5′-GTTCTGCTGCATTGCTTTTGC-3′;用于扩增内源CⅡTA基因的引物:上游引物为5′-ACTCCGGGAGCTGCTGCCCTGGC-3′,下游引物为5′-CCTGGAAGACATACTGGTCC-3′;用于扩增外源转染入CⅡTA基因的引物,上游引物为5′-AATTCTACACAATGCGTTGACAGTG-3′,下游引物为5′-GTTGGGAGGCCGTGGACAGTG-3′;用于扩增β-actin的引物为:上游引物5′-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3′,下游引物5′-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′。内源性CⅡTA基因的引物所扩增的片段为野生型CⅡTA分子N端的编码序列,因此其不能对各种CⅡTA突变体进行扩增。扩增外源性CⅡTA的上游引物与插入的寡核苷酸链互补,不能扩增内源性CⅡTA。1.2.7重组质粒puhd10-3/mcta的构建用EcoRI和XhoI内切酶,将pCDNA3mCⅡTA4突变体定向克隆到pUHD10-3四环素调控载体上(具体方法同前述),构建重组质粒pUHD10-3/mCⅡTA。将其转染入Raji细胞,筛选出MHC-Ⅱ类分子受抑的细胞克隆。将同一克隆细胞分别培养于6孔板,设立dox(强力霉素)浓度分别为:0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.6及4.0μg/L的7个实验组。培养4d,收集各孔细胞,用流式细胞术检测细胞表面HLA-DR的表达。2结果2.1pccda3/mciiita4突变体的构建采用T7通用引物对pcDNA3/mCIITA3和pcDNA3/mCIITA4突变体进行部分测序,结果见人工合成的两对寡核苷酸成功地连接到pcDNA3/mCIITA2上,表明pcDNA3/mCIITA3和pcDNA3/mCIITA4突变体已构建成功。2.2hla-dr/dq表达变化应用流式细胞术和RT-PCR检测Hela细胞/Raji细胞在IFN-γ刺激前后HLA-DR/DQ表达的变化。Hela细胞原本不表达HLA-DR/DQ,IFN-γ刺激后明显表达HLA-DR/DQ。Raji细胞原本表达HLA-DR/DQ,IFN-γ刺激后,HLA-DR/DQ表达未见明显增加(图1)。2.3hla-drmrna的诱导表达挑选各种质粒转染的Hela细胞克隆各15个,分析细胞表面HLA-DR/DQ分子的变化,可见转染pcDNA3和pcDNA3mCⅡTA2突变体后,各个克隆表面的HLA-DR/DQ诱导表达均未受明显抑制;转染pcDNA3mCⅡTA3后,15个克隆中有7个克隆表面HLA-DR/DQ分子的诱导表达受明显抑制。从典型的受抑克隆中抽提RNA,用RT-PCR检测HLA-DRmRNA表达的变化,同样证实转染pcDNA3和pcDNA3mCⅡTA2后,不能使HLA-DRmRNA的表达受抑;而转染pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4后,可使HLA-DRmRNA的表达受抑制(图2)。2.4表面hla-dr/dq分子表达的抑制作用挑选各种质粒转染的Raji细胞克隆各15个,分析细胞表面HLA-DR/DQ分子的变化。可见转染pcDNA3和pcDNA3mCⅡTA2突变体后,各个克隆表面HLA-DR/DQ分子的表达均未受抑制;转染pcDNA3mCⅡTA3/pcDNA3mCⅡTA4后,15个克隆中分别有8/9个克隆的表面HLA-DR/DQ分子的表达受明显抑制(表1)。mRNA水平的检测与分子水平的检测相吻合(图3)。2.5dox浓度对hla-dr表达的影响收集各孔dox刺激过的细胞,用流式细胞术检测。可见当dox浓度为0时,HLA-DR分子表达的受抑率为98%,当dox浓度增加到1.6μg/L时,HLA-DR分子表达的受抑率已接近0,dox浓度为4.0μg/L时,HLA-DR分子表达的受抑完全解除。从图4可见,改变培养液中的四环素的浓度,可使HLA-DR分子的受抑率改变。dox浓度越高,HLA-DR的表达受抑越少,即HLA-DR的表达越明显;dox浓度越低,HLA-DR的表达受抑越明显,即HLA-DR的表达越少。dox浓度与HLA-DR分子的表达受抑率呈明显的负相关(r=-0.99,P<0.01)。3puhd10-3和cda突变体的表达CⅡTA分子的N端和C端分别具有不同的功能,N端反式激活区域对MHCⅡ类分子起重要的调控作用。CⅡTA突变体的构建思路正是从破坏上述N端的结构功能区域着手。我们去除了N端180个氨基酸区域,构建了各种CⅡTA突变体。结果显示,转入CⅡTA突变体pcDNA3mCIITA3、4后,HLA-Ⅱ类分子的受抑率高达93.6%,与文献报道的基本一致,证实突变体在抑制HLA-Ⅱ类分子的表达上是有效的。pUHD10-3载体含有1个四环素调控元件,它的表达量与培养环境中的四环素(或强力霉素)浓度是相互依赖的。利用载体pUHD10-3的这一特性,可调节连接在这个载体上的目的基因的表达量。这点,在许多基因的功能研究中是很有帮助的。关于CⅡTA突变体抑制MHC-Ⅱ类分子表达的机制,推测是,CⅡTA突变体通过与胞内野生型的CⅡTA竞争结合反式作用蛋白,进而抑制MHCⅡ类分子的表达,但这一推测未得到实验证实。要使这一推断得到证实,最好的办法是观察胞内CⅡTA突变体的表达量与HLA-DR分子表达量之间的关系。Walter等用载体pUHD10-3对CⅡTA与MHC-Ⅱ类分子表达的关系进行研究,发现CⅡTA与MHC-Ⅱ类分子的表达量是相互依赖,这提示我们可将pUHD10-3引入到CⅡTA突变体的研究中。实验结果可见,挑选转入CⅡTA突变体后HLA-DR典型受抑的克隆,将其置于含几种不同浓度的强力霉素的营养液中,经过培养,HLA-DR分子的受抑出现了不同程度的缓解。在内源性CⅡTA的量相对恒定的情况下,dox浓度的变化,可引起胞内CⅡTA突变体表达量的变化,通过下游一系列反应,最终表现为Raji细胞表面HLA-DR分子的表达量或受抑率的变化。这一实验首次证实“CⅡTA突变体通过与胞内野生型的CⅡTA竞争结合反式作用蛋白,进而抑制MHC-Ⅱ类分子表达”的推测。本研究中采用脂质体转染法,将CⅡTA突变体导入受体细胞并利用G418长期筛选出稳定表达的细胞克隆。实验中涉及到的关键是接种细胞的密度和G418的浓度。细胞密度不同、细胞活力状况不同,可杀死未转染外源基因的细胞所需的G418浓度就不同,这是一个十分复杂的、随机性很强的工作。结果显示,有些细胞克隆表面HLA的表达未受抑制或受抑不明显,可能是由于不同细胞摄入的外源DNA量不同所致。由于摄入外源DNA的效率不是随着单一增加外源DNA的量就可以增加,所以在提高转染