白花丹参总丹参酮对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型的治疗作用

白花丹参总丹参酮对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型的治疗作用

动脉硬化性血栓形成（tho）是一种特定的非动脉硬化性疾病，主要影响小腿骨和周围血管，主要影响下肢中的小动脉和静脉。其临床特点为患肢皮肤发凉、间歇性跛行,严重者有肢端溃疡或坏死,是我国慢性周围血管病中较常见的病种。白花丹参(SalviamiltiorrhizaBungef.alba)是唇形科植物丹参的变型,主产于山东,根入药。除具有丹参的作用和用途外,临床发现白花丹参对治疗TAO具有独特疗效,为了探讨白花丹参治疗TAO的有效物质及其机理,本文从体征、病理变化及血清中TXB2、6-K-PGF1α、ET等方面观察了白花丹参总丹参酮对TAO大鼠模型的影响。1材料表面1.1实验动物Wistar雄性大白鼠60只,体质量280～300g,由山东大学实验动物中心提供。1.2化学试剂及试剂白花丹参总丹参酮提取物(由本实验室制备)、LCMS-2020色谱仪(岛津公司)、乙腈(色谱纯)、冰乙酸(分析纯)、通塞脉片(江苏南星药业有限责任公司),批号:Z32020535、月桂酸(国药集团化学试剂有限公司),批号:F200909284;血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、ET酶免试剂盒(RD公司),批号:20110501A。1.3高效液相色谱法取白花丹参总丹参酮提取物约5mg,精密称定,置5mL容量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过即得。参照文献采用AgilentEclipseXDB-C18柱(250mm×4.6mmi.d,5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A相,以0.1%乙酸水溶液为流动相B。线性梯度洗脱时间程序为0min,20%A;20min,60%A;50min,80%A;流速0.8mL/min;UV检测波长270nm;进样量10μL。2方法2.1模型制备和给药60只大鼠随机为假手术组(6只)、模型组(10只)、通塞脉片阳性对照组(10只)、白花丹参高剂量组(11只)、中剂量组(12只)和低剂量组(11只)。参照文献方法稍加改进,制作TAO模型:将大鼠用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉,右下肢股内侧剪毛。酒精皮肤消毒,纵行切开约1.5cm切口,游离股动脉,用动脉夹阻断血流,假手术组于动脉夹下方远心端注入0.2mL生理盐水,其余大鼠注入0.2mL月桂酸。各组均于注射月桂酸后15min去掉动脉夹,缝合皮肤,观察结果。各组均于手术前灌胃给药,通塞脉片对照组给通塞脉片0.66g/kg,高剂量组给白花丹参总丹参酮提取物40g/kg(相当于生药浓度),中剂量组给白花丹参总丹参酮提取物20g/kg,低剂量组给白花丹参总丹参酮提取物10g/kg。假手术组和模型组均给予等容量羧甲基纤维素钠溶液,1次/d,连续1w。2.2疾行状况分级标准大体观察大鼠患肢皮肤颜色、温度、患肢有无肿胀、有无坏疽及坏疽的程度、跛行状况。参照王军等采用的分级标准分级,Ⅰ级:病变局限于趾甲部;Ⅱ级:病变局限于趾部;Ⅲ级:病变局限于足爪部;Ⅴ级:病变局限于膝关节以下;V级:病变发展到膝关节以上。2.3纤维组织病理学观察全部送检的截肢标本解剖出月桂酸注射处以下部位的动脉、静脉主干,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片、常规HE染色,观察血管平滑肌、纤维组织病变情况。同时分别对动脉壁炎性细胞浸润、纤维增生等情况进行观察。2.4血浆txb2、6-k-pgf1、et试验采用酶联免疫法测定,具体步骤参照说明书。2.5统计处理实验数据用x¯±sx¯±s表示,计数等级资料采用秩和检验,计量资料采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析处理。3结果3.1紫外吸收色谱图/UV/MS图谱获取按“1.3”项下色谱条件,对白花丹参总丹参酮的主要成分进行分析,所得到紫外吸收色谱图(图1-A)与总离子流色谱图(图1-B)基本吻合。应用ESI-MS技术,对总离子流色谱图中的各色谱峰经质谱扫描后得到一级质谱图,按各色谱峰的质谱图与文献核对,对相应的化合物进行了结构推测,结果见表1。3.2肢体长期造模肢体劳动大鼠经股动脉注入月桂酸造模后,各鼠患肢皮肤温度降低,约5min后足爪部开始出现不同程度的苍白,肿胀。次日造模成功的大鼠均出现造模肢体缺血表现、跛行或拖曳现象、肢体青紫颜色加深并逐渐向上发展。一周内有部分大鼠出现肢端糜烂、溃疡及炎症反应,有脓液渗出,恶臭味,少数大鼠出现患侧坏疽部分脱落,患肢的胫后肌群出现严重坏死。模型组的病变最严重,通塞脉片组与中、高剂量给药组的病变最轻,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),低剂量组与模型组比较没有显著性差异,见表2。3.3血栓形成的组织假手术组股动脉均呈通畅状态,内膜光滑完整,无剥离和脱落现象,血管内无血栓形成,无炎性细胞浸润;TAO模型大鼠股动脉内均有不同程度的血栓形成。对于模型组,在低倍镜下观察,表现为动脉壁增厚,动脉管腔内发生血栓性闭塞,未见再通,内膜大部分脱落,外膜炎性细胞浸润较其他组别明显,伴行静脉内亦有血栓形成;在高倍镜下观察,内皮细胞部分发生水肿、变性、坏死或脱失。通塞脉片组与中、高剂量给药组的血栓范围均减少,管腔较规则,血管及周围组织少量炎性细胞的浸润,炎症反应减轻。低剂量组动脉壁增厚,炎性细胞浸润及血栓形成较严重,效果不明显。见图2。3.4各组大鼠血清中6-k-pgf1、txb2、et的含量比较与假手术组比较,模型组血清中6-K-PGF1α含量降低,TXB2、ET显著升高(P<0.05);与模型组相比,通塞脉片组及白花丹参总丹参酮高、中剂量组6-K-PGF1α含量显著升高,TXB2、ET含量与模型组降低(P<0.05)。低剂量组TXB2含量显著降低(P<0.05),但6-K-PGF1α及ET的含量改变不明显。见表3。4丹参酮a、txb2、et目前,TAO的发病机制尚未完全阐明,但血管内皮细胞(VascularEndothelialCell,VEC)功能受损是其重要的一个方面。内皮素ET、血栓素TXA2及前列环素PGI2等是由VEC直接合成分泌或经VEC转化的生物活性物质,这些物质与血栓的形成密切相关。丹参酮对心血管系统具有广泛的作用,主要表现为对血管内皮细胞的保护作用。体内外实验证明,丹参酮具有抑制炎症的作用,这种作用可能与丹参酮抑制炎症细胞内细胞因子的产生有关,同时与抑制花生四烯酸的代谢也有关系。丹参酮ⅡA可降低全血血小板粘附分子CD41和CD62P的表达,从而起到抗血栓形成和血小板聚集的作用。本实验研究发现造模后均有不同程度的血栓形成,TXB2、ET含量显著升高,6-K-PGF1α含量降低。TXA2、PGI2系统的失衡及ET含量的升高加重和促进了TAO的形成和发展,这些因子既反应血小板的聚集情况,更可反应血管内皮的抗血栓功能。造模大鼠经白花丹参总丹参酮治疗后,