盐碱胁迫对马铃薯试管苗生理指标及叶部细胞超微结构的影响

盐碱胁迫对马铃薯试管苗生理指标及叶部细胞超微结构的影响

红薯是重要的食物和蔬菜种类，具有丰富的养分和对人体的有益影响。因此，它在世界各地种植。种植的总面积和种植区只有小麦、玉米和水稻。由于马铃薯属于盐碱表现敏感的作物,盐碱胁迫会严重影响马铃薯的代谢活动,如生长发育受抑制、光合速率降低、蛋白质合成受阻,能量代谢缓慢等,进而影响了马铃薯的生产。以往国内外学者对马铃薯在盐胁迫和碱胁迫下的生理生化指标研究的较多,但是对马铃薯在盐碱共同胁迫方面的报道较少。我国境内分布着大面积的盐碱土,总面积约1亿hm2,而且类型较多,分为盐土、碱土以及盐化和碱化土壤三大类。在我国境内,无论是滨海或内陆、低地或高原都分布着不同类型的盐碱地,总体来说主要分布在干旱、半干旱和半湿润地区。马铃薯种植区域大多分布在此范围内,因此,研究盐碱对马铃薯生长发育的影响更具现实意义。本研究选定较耐盐的东农308和盐敏感的费乌瑞它为试验材料,利用NaCl和NaHCO3结合的方式模拟盐碱条件,对2个马铃薯品种的试管苗进行盐碱胁迫处理,旨在研究不同品种在此盐碱胁迫条件下的生理生化指标的变化以及变化幅度的大小;并通过在细胞层面上对超微结构的观察,探寻可以评定耐盐性强弱的指标,为筛选和培育马铃薯耐盐品种提供理论和基础数据。1材料和方法1.1试验材料以马铃薯品种东农308、费乌瑞它的试管苗为材料,由东北农业大学马铃薯研究所组培室提供。1.2试验计划1.2.1组织培养室的培养剪取马铃薯脱毒试管苗,使每个小茎段只带有一片叶,插入含有MS培养基的方瓶中,于温度条件为25℃左右、光照条件控制在2000~3000lx、每日光照16h的组织培养室进行培养,确保环境中无菌。1.2.2抗氧化酶活性的测定盐碱处理培养基的配制:MS培养基+60mmol/LNaCl+15mmol/LNaHCO3,普通MS培养基为对照。试验材料的培养:取20d苗龄长势较壮的试管苗,剥去苗的顶芽和基部,留取中间的茎段,单节切段培养,每段只有一个叶片,每瓶插10个茎段,每个处理和对照至少接种10瓶,培养3周后取样,分别进行叶绿素、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性生理指标的测定和电镜样品的制备。浓度选定依据:经过一系列盐碱浓度的筛选,发现在此盐碱浓度下,两品种的长势受到不同程度的抑制,但并没有导致死苗,而且也模拟了中度盐碱化土壤环境。1.3测量1.3.1a、sod和pod活性的测定叶绿素含量测定采用乙醇-丙酮混合液法;MDA的测定采用硫代巴比妥酸法;SOD活性的测定采用氮蓝四唑法;POD活性的测定采用愈创木酚法;CAT活性的测定采用H2O2紫外吸收法。1.3.2超声检测方法取处理及对照顶部展开的第3、4片叶,要避开叶脉,用刀片切成1mm×3mm规格的长方形,分别用2.5%、pH=6.7的戊二醛和1%锇酸固定液进行2次固定,均在4℃条件下固定2h→0.1mol/LpH=7.2磷酸缓冲液漂洗3次→分别用50%、70%、90%、100%系列乙醇依次进行脱水→100%乙醇和100%丙酮1∶1混合,在4℃下进行→加100%丙酮置于室温中5min→EPON812环氧树脂渗透、包埋→置于恒温箱内聚合→ULPRACUT-EXINXIN型超薄切片机切片→醋酸铀-枸橼酸铅双染色,H-7650型透射电子显微镜观察、拍照。2结果与分析2.1盐碱胁迫对马铃薯抗氧化酶系统的影响叶绿素为绿色植物光合作用提供了物质原料,它包含叶绿素a和叶绿素b。叶绿素含量的多少及变化趋势是作物叶片生理活性变化规律的重要指标之一,也直接影响着光合能力的强弱以及产物的多少,最终制约着植物的产量。由图1可以看出,通过盐碱的胁迫,2个品种的叶片叶绿素含量均下降,与对照相比,东农308降低的幅度较小,降低了25.68%,而费乌瑞它降低的幅度比较大,降低了72.6%。MDA是脂质过氧化的直接产物,当植物受到逆境胁迫时,生物膜的过氧化作用会导致膜的结构和功能受到损伤,可以通过它的含量判断膜脂过氧化的程度,是在抗性生理研究中的一个常用指标。由图2可见,经盐碱胁迫后,2个品种的MDA含量都上升,而且上升的幅度比较接近,东农308上升了31.89%,费乌瑞它上升了27.55%。SOD是植物体内保护细胞膜系统免受氧自由基侵害的保护性酶,可以清除细胞中多余的超氧根阴离子。由图3可见,经盐碱胁迫后,2个品种的SOD活性均表现为升高,东农308上升了3.69%,费乌瑞它上升了0.81%,前者上升的幅度是后者的4.5倍。POD是植物保护酶类之一,普遍存在于植物体内,是活性较高的一种酶,它与植物的光合作用、呼吸作用有着密切的关系。从图4中可以看出,2个不同品种马铃薯试管苗的POD活性在盐碱胁迫条件下均上升,东农308的活性提高了19.58%,费乌瑞它的活性提高了9.73%,前者上升的幅度是后者的2倍。CAT是C3植物中的关键酶,主要用于清除胁迫条件下产生的H2O2,其活力与植物的抗逆性密切相关。由图5可以看出,经盐碱胁迫后,2个不同品种的试管苗CAT活性均表现出下降的趋势,东农308下降了25.44%,费乌瑞它下降了54.93%。可以推测在盐碱胁迫条件下,马铃薯试管苗的CAT活性受到了抑制。2.2盐碱胁迫对叶绿体及基质片层的影响正常情况下,2个品种的细胞膜清晰可见,质壁贴合紧密,细胞饱满;叶绿体数量多,被膜结构清晰,基粒和基质类囊体膜结构突出;基粒排列整齐,叶绿体内具少量淀粉粒和分布零散的嗜锇颗粒;线粒体的内、外膜及嵴清晰可见,数量少,围绕在叶绿体周围,整个细胞发育较好(图6和图7)。在盐碱胁迫下,2个品种的细胞结构都被破坏,发生不同程度的皱缩,出现质壁分离,东农308经过盐碱胁迫后,叶绿体结构受到了轻微损伤,发生皱缩,边缘膜变模糊,内部可观察到较多的空化泡状结构,嗜锇颗粒体积增大,片层结构歪曲,基粒的类囊体片层数明显减少,有的甚至解体,只存在一些松散的片层结构(图8);细胞中的线粒体数量有少许增多,其他变化不明显。费乌瑞它经过盐碱胁迫后,叶绿体在数量上明显减少,体积减小,发生严重的变形,由长椭圆形变为圆形,有的近似球状,类囊体排列紊乱,基粒和基质片层界限模糊不清,叶绿体内基粒数目变少、堆叠层数也减少并且发育不良,内部的嗜饿颗粒变大,淀粉粒增多(图9);细胞中的线粒体数量明显增多、且外膜胀大,内、外膜之间的界限变得模糊不清,难以辨认。线粒体基质着色不匀称,有的深,有的浅,线粒体嵴减少,有的甚至有断裂迹象,总之发育较差,不能充分发挥其功能。由此可见,费乌瑞它的细胞受损害程度比东农308的大。3东农243对盐碱胁迫下植物细胞超微结构的影响盐碱逆境是影响植物生长发育的主要因素之一。盐碱胁迫下植株对盐分的吸收增加,并不断在植物体内积累,使Na+/K+比值升高,打破了两者的平衡,植物膜结构和功能会因此受到伤害,同时也会使光合产物的运输受到阻碍。植物耐盐碱性生理生化指标是了解植物耐盐碱机理和对盐碱耐受能力的基础,是综合性状的集中表现,不同植物有着不同的耐盐方式,其植物组织或植物细胞的生理活动和代谢物质也各不相同。在盐碱胁迫下,植物的叶绿素酶的活性增强,植物细胞色素系统遭到破坏,导致叶绿素含量降低;此外,由于质膜受到活性氧的攻击,使MDA的含量增加,引起膜质过氧化的水平提高,造成膜系统的损害;生物和非生物胁迫都可使植物体内的活性氧水平上升,SOD、CAT和POD3种酶是细胞抵御活性氧伤害的关键性保护酶。它们在清除O2-·、H2O2和过氧化物,阻止或减少羟基自由基形成,从而保护膜系统免受损伤方面起着重要作用。本试验中,在盐碱胁迫条件下,2个品种的SOD、POD活性均表现为上升,这是马铃薯试管苗适应盐碱胁迫的一种应激性保护反应,而CAT这一指标是下降的,可以推测此盐碱浓度已经严重抑制了CAT的活性,也说明了抗氧化酶的活性只能在一定的胁迫条件下体现植物抵抗逆境的能力,一旦严重破坏了活性氧产生与消除的平衡系统,酶活性就会受到抑制,此研究与包云飞等研究结论基本一致。在逆境胁迫下,植物细胞内各种细胞器都会发生不同程度的变化,叶绿体是对盐碱胁迫最为敏感的细胞器,它的完整性和规则性决定了光合生产能力的大小,也是逆境胁迫下植物细胞超微结构研究的主要内容之一,它很容易受到损害。在未受胁迫条件下,叶绿体内类囊体排列整齐,基粒片层与基质片层大体上与叶绿体长轴平行,排列规则,清晰易分辨,叶绿体膜保持完整。盐胁迫后发现叶绿体超微结构变化十分明显,如类囊体排列紊乱、外形肿胀变形,基粒排列方向改变,基粒和基质片层的界限不易分辨,嗜饿颗粒增大、增多,内外膜解体,叶绿体形状变为圆形,被膜破损或消失,甚至解体。而线粒体是植物体内动力的主要来源,是消耗氧的细胞器,氧浓度较低,活性氧产生的较少,对于逆境胁迫表现的不敏感,所以受损伤程度与叶绿体相比较弱一些,被认为是对盐碱胁迫表现不敏感的细胞器。综合以上生理指标和细胞超微结构的研究,可以得出在盐碱胁迫条件下,东农308对盐碱胁迫的耐受力要强于费乌瑞它,此研究为耐盐碱品种的筛选和生产中抗逆栽培提供了一定的依据。本试验选择试管苗为材料,可排除