费乌瑞它马铃薯茎尖培养及分化再生苗的脱毒研究

费乌瑞它马铃薯茎尖培养及分化再生苗的脱毒研究

甘薯病毒和纺织锤头病毒（以下简称简称病毒）主要采用茎尖组织培养法，结合清热、低温处理法和抗病性药物法，提高脱毒效果。其中,热处理结合茎尖组织培养法是一种应用较广的马铃薯脱毒方法,在葡萄(Vitisvinifera)、草莓(Fragaria×ananassaDuch.)和苹果(Maluspumila)等植物上也有报道。但由于不同植物或同一植物不同品种基因型和生理特性的差异,茎尖分化成苗的难易程度也不一样。以盖琼辉等、Iqbal等研究的马铃薯茎尖分化成苗培养基作为参考,在同一培养基上对克新1号、夏波蒂、费乌瑞它、陇薯3号、布尔班克、青薯9号、早大白、冀张薯8号等品种的茎尖培养后发现,这些品种茎尖分化成苗所需的最适培养基不尽相同,其中,费乌瑞它品种较难成苗,夏波蒂品种最难成苗。费乌瑞它马铃薯是榆林地区近年来引进的优良品种之一,该品种具有抗性强、产量高、品质优的特点。但随着种植年代的增加,不同病毒或类病毒在块茎体内不断积累,造成产量和品质逐年下降。因此,及时、有效地控制病毒的传播是做好脱毒马铃薯产业的关键。目前,国内关于费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的文献报道较少。本研究针对费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗率较低的原因,以热处理结合茎尖剥离脱除病毒和类病毒为目标,筛选费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗最适宜的培养基,并通过RT-PCR方法检测再生苗病毒和类病毒的脱毒率,为脱毒苗扩繁和种薯繁育奠定基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1马铃薯无菌苗体系采集田间疑似带毒马铃薯植株的块茎,低温休眠后,室温暗处催芽,消毒后接种在MS固体培养基上培养,待成苗后扩繁,从而建立马铃薯无菌苗体系。用RT-PCR方法检测并挑选分别含有3种病毒(PVX、PVY、PLRV)和纺锤块茎类病毒(PSTVd)的2种材料,由榆林学院生命科学学院保存备用。1.1.2trizel试剂培养基及不同植物生长调节剂所含药品,均购自北京康贝斯生物科技有限公司;病毒检测的Trizol试剂购自invitrogen公司;cDNA合成试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖等购自北京全式金生物科技有限公司。1.1.3-catagcgt-3根据GenBank数据库上PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因组序列,利用软件Primer5设计4对特异引物,分别是:PVX-F:5′-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3′,PVX-R:5′-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3′;PVY-F:5′-GCCAACTGTGATGAATGGGC-3′,PVY-R:5′-TGTACTGATGCCACCGTCCA-3′;PLRV-F:5′-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3′,PLRV-R:5′-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3′;PSTVd-F:5′-GATCCCCGGGGAAACCTGGAGC-3′,PSTVd-R:5′-GATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。预期PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因组序列的扩增片段大小分别为620、400、336和251bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,用灭菌TE(pH8.0)稀释至浓度为10μmol/L。1.2方法1.2.1诱导诱导病毒培养取生长至高约1~2cm的马铃薯无菌苗,在植物培养箱内升温1℃/d驯化20d左右,然后38℃光照培养4h、24℃光照培养12h,光照度3000lx,最后20℃暗培养8h,变温热处理4周以钝化病毒。1.2.2培养基的组成以MS为基本培养基,添加不同质量浓度配比的植物生长调节剂,其中,细胞分裂素6-BA的6个浓度分别为0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150mg/L,生长素NAA的4个浓度分别为0、0.025、0.050、0.075mg/L,赤霉素GA3的浓度为0.100mg/L,共组成24种培养基,蔗糖30g/L,卡拉胶5g/L,pH5.8。1.2.3愈伤组织的诱导率剪取热处理后长势较好的无菌苗(部分扩繁无菌苗因耐热差而长势弱或死亡),以注射器针代替解剖针在40倍的体视显微镜下进行茎尖剥离。因剥离茎尖越大,成活率越高,但脱毒率低,为提高再生苗的脱毒率,试验全部剥离带1个叶原基的茎尖,茎尖大小约0.1~0.2mm,壮苗茎尖稍大,弱细苗茎尖稍小。培养温度24℃,光照时间16h/d,光照度3000lx。为了降低污染率,每个试管只接种1个茎尖,每个处理的培养基接种40个茎尖。8d后观察并记录茎尖生长情况,15d后统计茎尖的愈伤组织诱导率、分化成苗率。愈伤组织诱导率=形成愈伤组织个数/接种茎尖个数×100%;分化成苗率=分化成苗个数/接种茎尖个数×100%。1.2.4马铃薯再生苗的诱导诱导物合成为检测马铃薯茎尖剥离再生苗病毒和类病毒的脱除情况,随机挑选热处理前携带3种病毒(PVX、PVY、PLRV)和类病毒(PSTVd)且茎尖剥离分化后长势良好的再生苗各20株,扩繁2代后分别以RT-PCR法进行病毒检测。Trizol法提取马铃薯再生苗叶片总RNA,反转录(RT)合成cD-NA,PCR分别扩增不同病毒和类病毒的目的基因片段,1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。PCR反应体系为:模板DNA3μL,正向(F)引物1μL,反向(R)引物1μL,10×PCRBuffer5μL,2.5mmol/LdNTPs4μL,TaqDNA聚合酶1μL,加ddH2O至50μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,PVX、PSTVd50℃(PVY、PLRV59℃)退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。2结果与分析2.1分离后的愈伤组织诱导及分化成苗率从表1可以看出,剥离带1个叶原基的茎尖接种在不同激素组合的24种培养基中均能形成愈伤组织,F06培养基的愈伤组织诱导率最低,为37.5%;F13和F19培养基愈伤组织诱导率最高,为82.5%,表明费乌瑞它马铃薯的茎尖分生组织容易发生脱分化。但是茎尖分化成苗率相对低且差异较大,F19培养基没有分化成苗,F16培养基诱导愈伤组织再分化的能力最高,分化成苗率达47.5%,F17和F23培养基的分化成苗率也比较高,分别为37.5%和32.5%。所以,最适合费乌瑞它马铃薯的茎尖分化成苗的培养基为MS+0.075mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+0.10mg/LGA3。2.2分离培养基对愈伤组织生长的影响观察茎尖生长点的生长情况发现,除由茎尖剥离技术引起生长点破坏或接种速度慢造成茎尖失水而死亡外,8~12d时均能形成浅绿色的愈伤组织。15d后愈伤组织可分化出幼芽和单条主根(图1a),30d后观察成苗情况发现,除F19培养基只形成愈伤组织和根系而不能分化成苗外(图1b),其他23种培养基均能诱导愈伤组织分化成苗。不同培养基诱导分化再生苗的生长势有所差异,分化成苗率低的培养基,再生苗一般表现出植株茎干矮小纤细(图1c)或茎干粗细不均、叶片稀少(图1d)等现象;分化成苗率高的培养基,如F16、F17培养基上生长的再生苗生长势多数较好,表现为植株茎杆健壮均匀、叶片大而绿、根系多且发达(图1e、图1f)。由于通过愈伤组织形成再生苗可能发生变异,试验中发现个别再生苗虽生长健壮却失去费乌瑞它茎干原有的紫红色,叶片和茎干均为绿色(图1g),但扩繁后的再生苗又恢复了茎干的紫红色,是否发生变异还需通过逐代繁殖的田间植株表现来验证或分子遗传学分析鉴定。2.3再生苗中4种病毒pvx、pvy、plrv或类病毒的脱毒率凝胶成像检测发现,马铃薯茎尖剥离脱毒前后RT-PCR电泳条带差异明显(图2),其中,2、4、6、8泳道为脱毒前的检测结果,均扩增出不同病毒和类病毒的目的条带;3、5、7泳道和9泳道没有扩增出目的条带,表明被检测再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或类病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR产物检测出目的条带,表明还未脱除相应的病毒或类病毒。检测20株再生苗3种病毒PVX、PVY和PLRV后发现,20株全部不携带PLRV,18株不携带PVY,13株不携带PVX。2株携带PVY的再生苗同时携带PVX,表明X病毒较难脱除,Y病毒次之,卷叶病毒最容易脱除,3种病毒PVX、PVY和PLRV的脱毒率分别为65%、90%和100%。由类病毒PSTVd的检测结果发现,20株再生苗中有2株脱除了类病毒,脱毒率为10%,表明热处理结合茎尖剥离脱毒法很难脱除PSTVd。3后记和讨论3.1脱除马铃薯纺锤茎尖的制备方法热处理结合茎尖组织培养法是国内外普遍应用的马铃薯脱毒技术,能有效地脱除危害马铃薯生长的常见病毒和类病毒,如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是,不同病毒脱除难易差别较大,对一般马铃薯品种而言,通常PVS、PVX较难脱除,PLRV容易脱除,本研究的试验结果和国外一些学者研究的结论是一致的。对于PVS、PVX等较难脱除的病毒,主要采用的是热处理、低温疗法和病毒唑法等结合茎尖组织培养法。而脱除马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd,目前仍没有理想的方法,主要以筛选田间抗类病毒植株的块茎为主。在检测无体细胞变异的情况下,以二次或多次茎尖剥离法来提高类病毒的脱毒效果,但必需淘汰可能变异的组培苗,典型费乌瑞它马铃薯组培苗应具有紫红色茎干和叶片,首先从颜色上去除疑似变异组培苗,完全淘汰变异植株还需通过逐代繁殖的田间植株表现来验证或分子遗传学分析鉴定。茎尖组织培养法实质是剥离茎尖生长点的分生组织,剥离茎尖大小与脱毒程度有直接关系,剥离茎尖大,不易脱毒,剥离茎尖小,病毒易脱除但不易成活。本试验为获得脱毒效果更好的再生苗,以剥离带1个叶原基的茎尖为外植体,但同时降低了茎尖分化成苗率,与国内多数学者剥离带1~2或2~3个叶原基的试验区别较大。不同品种的马铃薯由于基因型和生理特性不同,需要不同的培养基环境。因此,筛选不同浓度激素及合适配比的培养基,对提高马铃薯茎尖分化成苗效果尤为重要。通过对不同品种茎尖分化成苗的培养基筛选试验发现,费乌瑞它马铃薯是较难分化成苗的一个品种,虽然F16、F17和F23培养基的分化成苗率较高,在此基础上还可探索更合适的培养基,由于培养环境、其他类型激素组合的培养基对茎尖分化成苗的影响也需进一步去研究。3.2荧光定量及多重rt-pcr检测目前,国内外检测马铃薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法,而马铃薯纺锤块茎类病毒只含有核酸,没有外壳蛋白,只能用RT-PCR法进行检测。在RT-PCR基础上,进一步发展了荧光定量及多重RT-PCR检测技术,