细胞系的建立及鉴定

细胞系的建立及鉴定2012.2.28细胞系：有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系细胞系/细胞的鉴定细胞系的建立：1.组织块方法2.单层细胞法原代培养

传代培养大量扩增细胞后用于实验研究使用前对细胞的组织特异性进行鉴定成骨细胞：没有唯一的特异性标志物

需数个指标联合证实表面标志：

表达ALP。Gomarri法

合成Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨钙素、骨粘蛋白、骨桥蛋白等骨基质蛋白。组织功能：

体外形成矿化结节。vonKossa染色法

体内成骨。免疫缺陷鼠皮下移植。破骨细胞：唯一特异性标志物破骨细胞含有丰富的酸性磷酸酶和抗酒石酸磷酸酶（tartratresisitantacidphosphatase,TRAP），TRAP染色阳性是破骨细胞的重要标识。另外破骨细胞表面有降钙素（calcitonin）受体，也可以作为标志物。形态学：多核细胞干细胞表面标志：CD44,STROL1,MUC-18 ,alpha-SMactin多潜能功能鉴定：成骨细胞功能：细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用Gomarri法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导剂处理后，用vonKossa染色法观察细胞在体外形成矿化物沉积的能力。牙髓干细胞：需多少个指标证实牙周膜干细胞：干细胞表面标记物:多潜能功能－－组织细胞分化及功能鉴定分化为脂肪细胞：油红O染色阳性肿瘤细胞系的生物学鉴定肿瘤细胞系建立后,要对其生物学性状进行鉴定,以便日后的研究有可比较的科学依据肿瘤细胞系的基本特性1.细胞系的来源符合原供体组织的病理学诊断原供组织的组织病理形态；动物接种肿瘤组织的组织形态；2.细胞系具有肿瘤细胞的特性:异种体内移植致瘤性3.体外无限生存的能力:细胞系连续传代60或80代次。

肿瘤细胞的生物学特征干系细胞：每个肿瘤内都含有一个或几个具有相对稳定特性的自我保持的（Selfmaintaining）细胞系。肿瘤的生长就是这些细胞系的增殖；非干系细胞：除了干系瘤细胞，肿瘤还具有失去自我保持能力的细胞的后代，可称为“肿瘤的非干系细胞”。动物肿瘤移植实验证实，肿瘤结节在新宿主身上多次传代之后仍具有原来肿瘤的主要特征，包括形态、生化、抗原及细胞遗传的标志。所有恶性肿瘤的转移瘤结节的细胞都具有与亲代原发病损类似的形态学及生物学性质。培养中的肿瘤细胞特性1．致瘤性：培养的肿瘤细胞移植到敏感动物后，可获得形成肿瘤的能力。证明细胞在体外能经过类似于体内肿瘤发生过程中出现的变化。动物接种形成的肿瘤应进行组织学、染色体及其它生物学标志的检查并与原接种细胞进行比较。致瘤性的判断移植瘤是判断细胞性质的关键步骤。首先，移植瘤的组织形态应与原肿瘤组织一致。但有例外，细胞群体的性质可以与植入前不同，因为在植入的细胞中，只有特殊变异的细胞具有致瘤性，这些变种可能原来就存在于植入群体内，也可能是植入后产生的。在这种情况下可以确认接种的致瘤性。影响移植瘤生成的因素（1）植入细胞与宿主的免疫不相容：如接种的培养细胞来自纯种动物，接种时产生的抗原变化可能会产生致癌的阴性结果。可以将细胞接种到“不受免疫影响”的部位（如眼前房）用射线或免疫抑制剂抑制宿主的免疫反应；将细胞接种到免疫反应有先天性遗传缺陷的动物：（如无胸腺裸小鼠）。目前，多用裸小鼠评价培养细胞的致瘤性。（2）植入部位，例如，将瘤细胞接种到小鼠躯干接近头部位置的皮下，生瘤的阳性率及生长的速度比植到尾部高2－4倍。（3）植入部位微环境的潜在因素，某些细胞只有在植入部位找到最佳的微环境时才形成肿瘤。

生瘤性与细胞其它性质的关系

细胞在基质上铺展的面积与生瘤性有关。微丝束的结构破坏。许多生瘤细胞系均有大量的微丝束变化，它与形态转化有关。停泊依赖性与生瘤性联系最密切。在动物体内不形成肿瘤的细胞系，在半固体培养基内形成集落的能力也低；与之相反，而大多数能在动物体内生瘤的细胞系，形成集落的效率也高。2．生长参数和细胞行为的变化丧失停泊依赖性（anchoragedependency）一般情况下，原代成纤维及上皮细胞悬浮培养时不能增殖，它们只有铺展在固体基质上才能增殖。在肿瘤性演化过程中，相当一部分的细胞群体获得在悬浮状态形成集落的能力，并不需贴附在基质上。

丧失生长抑制性当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。密度依赖性抑制正常贴壁性细胞的增殖率,随着每单位基质面积内的细胞群体的局部密度增加而下降。这一现象称为密度依赖性抑制(densitydependentinhibition)。或生长接触抑制(contactinhibitionofgrowth),但二者并