第五章第五节基因克隆技术

第五章第五节基因克隆技术主讲人：吴玉琴其他组员：沈远志、谭顺坚、林敏婷、梁丽欢、何东明在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。5.5基因克隆（clone）技术在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。

5.5.1RACE技术(rapidamplificationofcDNAends)

是由Frohman等(1988)发明的一项技术。是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。一般分5’RACE和3’RACE两种：

3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。巢式PCR（nestPCR）：是指利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。5’RACE3’RACE

利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA；再用RNase水解模板链；然后用一个基因特异引物GSP作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universalprimer）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3'末端的DNA片段扩增出来。RACE的另一种代表方法是自我连接法（Self-Ligationmethod）1、反转录（RT）反应2、HybridRNA的分解3、单链cDNA的自身连接4、PCR扩增5‘未知区域5、目的DNA片段的切割回收6、DNA序列测定5.5.2cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。PCR产物的特异性和所得的cDNA片段纯度均高。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。5.5.3Gateway大规模克隆技术