植物的抗寒性检测

植物的抗寒性检测主讲人员：小组代号：小组成员：CompanyLogo实验主要内容实验背景实验目的实验原理实验步骤1234

注意事项5CompanyLogo实验背景我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害，常常给越冬作物和果木造成严重伤害。冻害由0℃以下低温造成，冷害由0℃以上低温引起，冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强弱决定其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而选育抗寒性强的果树品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。本实验重点学习实验室间接鉴定植物抗寒性的检测方法。CompanyLogo实验目的YourTexthereYourTexthereYourTexthere1、了解植物的抗寒性机制并掌握实验室间接鉴定抗寒性的检测方法。

2、掌握用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离POD同工酶的原理和技术。CompanyLogo实验原理实验室间接鉴定就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。在一定低温范围内，植物体内自由基的产生和清除之间基本上可以保持平衡。当温度持续下降时，活性氧自由基就会明显增加，清除剂含量降低，导致自由基积累，造成膜脂氧化。生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。CompanyLogo实验原理本实验采用同工酶分析测定法。同工酶带相对迁移率计算：Rf＝酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带一般比抗寒性差的品种多1～3条，且随着温度下降变化缓慢。CompanyLogo实验步骤实验步骤6、同工酶带相对迁移率计算1、材料处理2、贮液的配制3、凝胶板的制备4、电泳5、染色CompanyLogo一、材料处理植物枝条（花朵），将采回的枝条剪成40cm左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗掉泥土、灰尘），再用蒸馏水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的6份，其中一份作为对照，其余每份作为一个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝条放于超低温冰箱低温处理，处理温度梯度为：CK（0℃），-20℃，-25℃，-30℃，-35℃，-40℃。降温速度为4℃/h，达到目的处理温度后维持12h，然后逐步升温，升温速度亦为4℃/h。花朵的处理温度梯度为：CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃，-7℃，-8℃。CompanyLogo二、贮液的配制A．30%Acr－0.8%Bis贮液B．1MTris-HCl缓冲液（pH值8.8）C．1MTris-HCl缓冲液（pH6.8）D．电极缓冲液E．1%过硫酸铵溶液F．溴酚蓝溶液贮液的详细配制CompanyLogo三、凝胶板的制备①分离胶的制备分离胶浓度多为7%，按照表5－3进行配制。先用刻度吸管准确地吸取30%Acr－0.8%Bis和1MTris-HCl（pH8.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，除去溶液中气泡，抽气毕，再加入1%过硫酸铵溶液和

TEMED，摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板模具内，上面加一水层，在25～30℃的地方进行聚胶，约1h。CompanyLogo表5－3贮液不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）20ml30ml5%7%10%5%7%10%30%Acr－0.8%Bis3.24.56.54.96.89.71MTris-HClpH8.816.315.013.024.322.419.51%过硫酸铵0.50.50.5400.80.8TEMED（为μl）202020404040CompanyLogo②隔层胶的配制按表5－4进行隔层胶的配制，用刻度吸管准确吸取30%Acr－0.8%Bis和1MTris-HCl（pH6.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，与此同时，吸去分离胶上层的水层，抽气毕，加入1%过硫酸铵溶液和TEMED，立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速加入蓖子），其中加一水层，约1h可聚合好。CompanyLogo表5－4贮液不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）10ml20ml3%4%3%4%30%Acr－0.8%Bis1.01.32.02.61MTris-HClpH6.81.01.32.02.6重蒸水7.77.115.414.21%过硫酸铵0.30.30.60.6TEMED（为μl）15153030CompanyLogo③加样装置好垂直板电泳槽，用1%热琼脂封好缝隙。样品制备：每克鲜样加3.0ml0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH＝7.0），研磨，用纱布粗过滤。滤液离心：4000r/min，（0±2）℃，取上清液作供试酶液。用10伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样器吸取样品液分别每管加入50微升。Co