电镜观察样品时应注意几个问题

电镜观察样品时应注意的几个问题

一、对观察内容的初步鉴定

低放大倍数下（3000倍），根据细胞的形态和轮廓、细胞内和细胞间物质的伸延情况基本上可对组织类型做出初步判断。

二、正确使用放大倍数一般对组织的观察，从低倍开始；观察病毒在2-3万倍以上，观察大分子结构要10万倍以上。

三、局部与整体

通观全局，避免片面性。一个细胞的超薄切片只是一个细胞的1/100-1/500。观察时现场记录；典型的代表性结构需摄片；经常需设对照组；观察时2-3人为宜，对重要发现要相互核实。

四、形态与功能

例如，肾衰时，尿中钠离子增高，近曲小管上皮细胞变性。

五、动与静的对立统一

肝细胞寿命----18个月

红细胞寿命----120天，每人每天平均死亡一千几百亿红细胞

消化管内壁细胞寿命----几十小时

细胞发育早、中、晚期，机体发育幼年、青年、壮年、老年六、人工损伤及其识别

1、标本制作中人工损伤＊固定损伤:延误固定时间，固定液渗透压＊包埋损伤＊超薄切片损伤:刀痕，颤痕＊玷污:铅污染

2、电子束轰击七、电镜技术及其它先进技术结合

1、与中医相结合

2、与免疫电镜、细胞化学、能谱相结合扫描探针显微镜及其在

生物医学中的作用扫描探针显微镜及其在

生物医学中的应用

医学的每一步前进必然建立在科技发展的基础上，如1858年开始的光学显微镜观察使对疾病的认识到达了细胞水平，1950年出现的电子显微镜把对疾病的认识提高到了亚细胞水平。当代医学的发展已经到达了分子生物学广泛应用的时代，人们迫切需要对分子水平的结构、形态进行直接的观察，扫描探针显微镜（SPM）的问世正是满足了这一要求。

虽然电子显微镜的发明大大提高了成像分辨率，但苛刻的样品制备条件容易改变生物分子的天然结构；另外，高真空状态的成像偏离生物分子生理环境太远，使我们很难获得生物分子的真实结构信息和反应过程。应用SPM观察物体可达到10－8m，并可直接对标本进行观察，应用范围之广出乎人们的意料，其潜在的巨大作用正在被开发。

SPM主要类型有：扫描隧道显微镜（STM）、原子力显微镜（AFM）、扫描力显微镜（SFM）、扫描磁显微镜（SMM）等，随着SPM领域的新技术的高速发展，还会有新的型号出现，但其基本原理是建立在量子力学和压电材料技术上的。扫描隧道显微镜

扫描隧道显微镜（STM）是根据量子力学的电子隧道效应设计的。当针尖（探针）与样品表面距离小于1nm以下时，针尖电子云与样品表面电子云重叠----加上微小电压（2mV-2V）---针尖和样品间产生隧道电流样品++++++++++++++++++V(2mV-2V)++++++L＜1nm

针尖到样品表面原子的距离与隧道电流成指数关系，所以间距的变化对隧道电流的反应是十分敏感的。当针尖在样品表面扫描时，间距则随样品表面起伏不平的形貌而变化着，因而隧道电流也随之变化着。记录变化的隧道电流，则可获得样品表面的形貌特征，达到观察样品表面原子结构图像的目的。但是它要求被观察的样品必须具有导电性，因此对生物样品的观察就受到限制。原子力显微镜

原子力显微镜（AFM）的发明是建立在扫描隧道显微镜的基础上的，利用对微弱力极其敏感、顶端带针尖的微悬臂对样品表面进行逐行扫描，针尖最外层原子与样品表面原子之间的相互作用力使微悬臂发生形变或者改变运动状态，通过检测微悬臂的偏转获得样品形貌和作用力等相关信息供计算机成像。因此，AFM不要求样品具有导电性，待测样品不需要特殊处理就可以直接进行纳米尺度的观测。AFM在液态环境中也可成像，而且针尖对样品表面的接触作用力较小，能避免对样品造成大的损伤，所以AFM成为对自然状态下的细胞、生物大分子等进行纳米尺度实时观测的有效工具。生物样品标本制备

一般生物标本在常压、液态环境中可直接观察。培养细胞：取培养在玻片上的细胞，用PH7.4的PBS缓冲液洗，1.5%戊二醛固定5分钟，蒸馏水冲洗3次，干燥，AFM观察。生物样品超薄切片法：标本在冰冻的2%戊二醛固定后，经过0.1mol/lPBS缓冲液冲洗，乙醇梯度脱水，环氧丙烷中过夜，环氧树脂包埋，半薄切片定位，超薄切片捞在新解离的云母上，干燥后用AFM在空气中进行观察。应用

AFM对细胞膜表面研究分为：第一阶段是对大量的细胞膜表面（包括细胞内、外表面）外貌、粘度、硬度、弹性、力学等信息的观测。第二阶段是对膜表面的标记物（如抗体）和作用物（如药物和甾体物质）的观察。第三阶段对信息传导、细胞连接、细胞膜表面生化反应等的研究。目前研究主要处于前两个阶段。

AFM在核酸及其蛋白质复合物结构研究中的应用已日趋广泛。为了提高AFM成像分辨率、保证所获得结果的可靠性和再现性，必须重视DNA样品的制备过程。成像DNA分子时，选择合适的针尖、合适的成像方式、合适的成像环境，减小针尖和DNA分子间的力作用，都有利于提高成像质量。评价AFM的被测样品无需进行复杂的处理，对成像环境也没有什么特别要求，保证了所观察的样品表面结构的真实性。由于AFM针尖采集的表面结构图可在扫描过程中以三维形式直接显示到计算机屏幕上，因此可以定量分析被检测样品