淀粉酶及其同工酶

淀粉酶及其同工酶的检测2010100230石学丹淀粉酶(amylase，AMY,AMS)一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为

α-淀粉酶与β-淀粉酶α-淀粉酶

广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。

其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）

α-淀粉酶β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

（一）生化特性与组织分布1.生化特性α-amylase（AMY或AMS）是一种不均一性的钙依赖金属蛋白酶。AMY作用的最适pH在6.5～7.5，卤素和其他阴离子有激活作用（Cl

>Br

>NO3

>I

）。分子量40000～50000，易从肾脏排出。半寿期很短，约为2h。2.组织分布α-AMY分为两种同工酶：S-AMY和P-AMY。利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将S-AMY分为S1、S2、S3和S4四个亚型；P-AMY分为P1、P2、P3三个亚型。P-AMY和S-AMY可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体以非共价形式结合，形成高分子循环复合物，称为巨淀粉酶（Macroamylase，M-AMY）。M-AMY的分子量较大，不易从肾小球滤过，因此容易造成高淀粉酶血症。（二）测定方法与临床意义1.测定方法AMY总活性测定：化学法、酶偶联法同工酶测定：琼脂糖电泳法、免疫抑制法。2.临床意义（1）AMY活性增高①急性胰腺炎发病后3h～6h开始升高，12h～24h达峰值，2天～5天下降恢复至正常。超过500U有意义。②慢性胰腺炎急性发作、胰腺癌等AMY升高。③急腹症如急性阑尾炎、肠梗阻、溃疡现穿孔等，血清

AMY可升高。这些病变可波及胰腺，较急性胰腺炎为低。（2）AMY活性降低主要见于肝炎、肝硬化等。（3）AMY同工酶增高①急性胰腺炎和慢性胰腺炎急性发作P型增高；②腮腺炎、肺癌、卵巢癌等S型增高。淀粉酶活力的测定化学法二、实验原理酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。

本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37℃、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37℃、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需要的酶量。1U=1mg还原糖/min·mL酶

三.

实验材料及设备1、材料淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液）2、仪器分光光度计

恒温水浴

沸水浴3、器材

刻度试管：

25mL×17

移

液

管：

1mL×3（取稀释后的酶液）

烧

杯：250mL×1

滴

管：

2

洗

耳

球：

2

洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1

移液器：专取NaOH

注射器：专取蛋白样品四、试剂的配制1、淀粉溶液（0.5%） 称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）3、磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH6.8），含0.3%NaCl4、NaOH溶液（2.5mol/L）五.

操作步骤1、淀粉酶的制备（1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗酶提取液解冻，取上清液0.05mL，加蒸馏水稀释到25mL，摇匀备用（2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻，取上清液0.05mL，加蒸馏水稀释到25mL，摇匀备用（3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取0.05mL，稀释。收集1管的同学，将0.05mL稀释到15mL

收集2管的同学，将0.05mL稀释到10mL

试管排列顺序空白F1B3B2F3

F2

F1

B3

B2

B1F3F21淀粉32B1

粗酶液盐

析脱盐

0时刻5min时刻

装约20mL淀粉溶液，标记，转至37℃水浴锅中因淀粉中含有少量还原糖，某些溶液有色素、杂质，需查看酶不水解淀粉的情况37℃室温实验编号操作0号管粗酶液(1)盐析液(2)脱盐液(3)0时刻5min时刻0时刻5min时刻0时刻5min时刻B1B1’F1F1’B2B2’F2F2’B3B3’F3F3’淀粉酶液(ml)0.30.20.5H2O(ml)3.5pH6.8缓冲液各1ml0.3％NaCl

各1ml预热摇匀，37℃水浴2min

NaOH(ml)111111预热的淀粉各