细胞生物学技术：细胞结构成分分离的离心技术

细胞结构成分分离的离心技术细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理离心设备离心方法细胞结构成分的分离（略）Subcellularfractionation一.离心技术原理（Centrifuge)利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的离心力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技术。*分离细胞或其他的悬浮颗粒，从混有多种细胞的悬液中分离某一细胞；*从组织或细胞匀浆中分离细胞器，包括细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、质膜、内质网等；*分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。什么是离心力？匀速圆周运动的物体，在合外力消失或不足以维持向心力时，产生的背向旋转轴的运动力。3个因素：沉降系数相对离心力离心时间设备：离心机、离心介质溶液（细胞结构成分）：颗粒溶液、大小、密度特性1.沉降系数（S）：重要指标

颗粒在单位离心力的作用下的移动速度

dx/dtw2xdx:颗粒与转轴中心的距离dt：颗粒沉降所需时间W:角速度X:转子半径s(秒）=2r2(

p-

m)=9r:颗粒直径

p

:颗粒密度

m

:溶液介质密度

：溶液介质粘度1S=1×10-13s决定沉降速度的因素：与颗粒大小有关；与颗粒密度有关；与溶液介质密度和粘度有关。沉降系数密度离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用RCF数值表示，即同一颗粒在离心时的离心力同地球重力相比较后得到的值。RCF(g)=离心力/重力＝mw2x/mg=w2x/g=1.12r(RPM/1000)2r:

旋转中心轴至转头内离心管某一部位的半径

RPM（roundsperminute，转速):

转头每分钟旋转的次数RCF与转速及旋转半径正相关2.相对离心力（RCF）：重要指标3.离心时间

颗粒经过溶液形成沉淀所需要的时间

t=K/SK:表示转头离心效力的指标，与转速平方成反比。

离心机公司提供最高转速时的K值。

K值越小越好，效力越高。

S：沉降系数离心时间由离心效力和沉降系数决定性能指标：(1)离心力：能达到的RCF；(2)离心效力：K因子：k值越小，离心时间越短，转头的效力越高。离心机转头:离心技术的核心决定离心力RCF1×t1=RCF2×t2沉降离心中的两个因素RCF,t例：沉降某颗粒需10000g.min10000g1min2000g5min颗粒的沉降系数加在颗粒上的相对离心力离心时间离心分离首先需要知道的3要素二.离心设备：离心机及离心管4.温度控制（冷却设备）1.转头（马达）3.离心腔（真空设备）2.控制系统离心机分类制备型、分析型；常温、低温；台式、立式；低速、高速、超速低速：6800g(细胞级）分离>10000S的细胞及细胞器如：Beckman公司的J6，GS-6高速：17,700－50,400g（亚细胞级）分离>100S的颗粒，包括部分细胞器及病毒,

如：Beckman公司的J2超速：90,400－694,000g（分子级）离<100S的颗粒,如：Beckman公司的L,XLOptimaTML-XP（BeckmanCoulter)制备型超速离心机MaxRPM

100000MaxForce(xg)

802400性能指标：(1)离心力：能达到的RCF；(2)离心效力：K因子：k值越小，离心时间越短，转头的效力越高。1.离心机转头:离心技术的核心转头类别：转头与旋转轴的角度垂直转头verticalrotor近垂直转头<10°水平转头swing-outrotor90°0°固定角转头fixed-anglerotor24°沉淀的位置和沉淀形成的时间不同，决定得率和纯度短垂直转头近垂直转头固定角转头水平转头分离纯度分离时间低高长Beckman公司转头的标记SW:水平转头,如SW50.1；V：垂直转头,如VTi80；NVT:近垂直转头；Type:固定角转头,如Type80TiJA:使用在J系列的固定角转头，如JA.2JS:使用在J系列的水平转头，如JS.13.1数字：最高安全转速（×1000）；Ti:钛合金，未标记为铝合金

金属疲劳

转子内部的应力改变导致裂纹注意：安全系数>2；钛合金；转头寿命超速

测速盘（超速花盘）化学腐蚀

离心管破裂、样品渗漏

转头不平衡离心管平衡误差0.01g；离心管放置不对称；水平转头吊桶盖安装不当；转头不加盖；“O“形密封圈失效离心管帽、垫圈、接合器使用不当转头损坏及原因三.离心方法1.差速离心法

离心介质无密度梯度2.

沉降速度离心，又称移动区带离心

沉降平衡离心，又称等密度梯度离心

密度梯度离心法根据颗粒大小：1、2根据颗粒密度：3根据离心介质有无梯度：离心介质有密度梯度1.差速离心法（Differentialcentrifugation)原理：通过一系列递增速度的离心，依次将大小不同的颗粒逐级分离。大小颗粒混合物最大颗粒较大颗粒中等颗粒小颗粒上清上清上清上清用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞结构成分。特点：

介质密度均一；速度由低向高，逐级离心；

操作简单；

分离纯度不高。密度梯度离心法离心介质有密度梯度s=2r2(

p-

m)9

形成的溶液密度范围大粘度低对细胞成分损伤小离心分离后容易去除浓度容易测定便宜理想的离心介质可自行配制的：蔗糖、商品化的：Ficoll,Percoll,Accudenz(Nycodenz),Metrizoate2.移动区带离心法（moving-zonecentrifugation)原理：用梯度蔗糖或甘油作为介质，将要分离的样品放在介质表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。介质密度逐渐增高s=2r2(

p-

m)9用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。分离效果只与颗粒大小有关，与密度无关。特点：

密度梯度介质，且密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度(

p>

m

)。离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。s=2r2(

p-

m)93.等密度梯度离心法（isodensitycentrifugation)原理：离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列区带，然后从管底收集。s=2r2(

p-

m)9用途：分离密度不等的颗粒,适用于病毒、DNA、RNA、蛋白质等，效果只与颗粒密度有关，与大小无关。特点：

密度较高介质，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度(

p<

m

)

。所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。细胞结构成分分离的离心技术离心技术原理离心设备离心方法细胞结构成分的分离1938Behrensnucleiandcytoplasmfromlivercells(differentialcentrifugation)1951Brakkeplantvirus(density-gradientcentrifugation)DeDuvelysosomes,peroxisomesMeselson,Stahl,Vinogradseparatingnucleicacid(equilibriumdensitygradientcentrifugationincesiumchloridesolutions)1984RothmanreconstituteGolgivesicletraffickinginvitro离心技术发展和细胞器分离From“Currentprotocolsincellbiology”

四.细胞结构成分的分离细胞沉淀细胞破碎细胞结构成分的分离－离心技术4.分离细胞器的鉴定和评价5.举例：线粒体分离、细胞核分离(略）1.介质密度为1g/ml;2.一般细菌和动物细胞密度为1.08-1.12g/ml,

病毒密度为1.18-1.31g/ml。3.相对离心力(g)和离心时间（min)决定沉降

材料大小(m)

离心条件(离心力，离心时间）动物细胞10-60200-500g5-15min人红细胞6-8500g5-15min细菌1-10500-6000g10-15min病毒0.02-0.0330000-40000g20-30min1.细胞沉淀（cellpellet)2.细胞破碎*渗透压冲击*超声波振荡*机械力研磨或剪切*反复冻融原则：只需破碎细胞膜，保留完整细胞器3.细胞结构成分的分步分离一系列的差速离心＋密度梯度离心差速离心：分离细胞器梯度离心：纯化细胞器沉淀RCF×时间内容物P11000g*10min细胞核、重线粒体、大片细胞膜P23000g*10min重线粒体、细胞膜碎片P36000g*10min线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、完整高尔基体P410，000g*10min

线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜P520，000g*10min溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜、大的高密度小泡P6100，000g*10min

细胞膜、高尔基体、内体等差速离心形成的沉淀（肝脏）差速离心差速离心需要的设备离心机：低速、高速、超高速转头：固定角、垂直或水平介质：蔗糖密度梯度离心梯度离心需要的设备离心机：低速、高速、超高速转头：水平、固定角、垂直介质：蔗糖、Ficoll,Percoll,Accudenz(Nycodenz),Metrizoate

介质的梯度形成装置和收集装置4.离心方法的选择匀浆物中各类细胞器大小不同：

差速离心上清中各类细胞器大小有差别：

速率区带离心上清中各类细胞器密度有差别：

等密度离心根据分离细胞器的性质：根据研究目的：分析分离：差速离心（时间短；介质浓度低，对细胞结构成分损伤小）制备分离：密度梯度离心（时间长，纯度高）4.离心方法的选择5.分离细胞器的鉴定和评价（1）形态鉴定：光镜或电镜（2）生化分析：细胞器特异的标志酶(2)生化分析：细胞器特异的标志酶细胞器标志酶细胞核NAD合成酶、DNA聚合酶线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶溶酶体酸性磷酸酶、－半乳糖苷酶过氧化物酶体过氧化氢酶、尿酸氧化酶内质网葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素P450高尔基体－半乳糖苷转移酶细胞膜5’-核苷酸酶、Na/K-ATP酶6.举例:细胞核分离原理：细胞核特征：体积大，沉降系数大；密度高，可通过浓蔗糖，分离容易。分离设计：

细胞破碎（机械匀浆，渗透溶胀，表面活性剂），释放细胞核，光镜鉴定释放效果。

离心，光镜鉴定分离效果从组织中制备细胞核细胞破碎：裂解缓冲液：0.25M蔗糖，

10mMTris-HClpH7.4,10mMNaCl（低渗）,3mMMgCl2,1mMDTT,0.5mMPMSF。

组织研磨器；

肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器离心：浓蔗糖溶液：2M蔗糖

组织匀浆产物和浓蔗糖溶液等体积混合

23000g，30min，4°C(白色沉淀)，水平转头(SW)6.举例:线粒体分离原理：线粒体特征：体积较大，沉降系数较大；类似大小的细胞器较多，但密度有差别。分离设计：细胞破碎（机械匀浆）差速离心，必要时密度梯度离心（1）从大鼠肝脏组织中制备线粒体细胞破碎：匀浆缓冲液（MS缓冲液，等渗）：0.21M甘露糖

5mMTris-HClpH7.5,70mM蔗糖,1mMEDTA

Potter-Elvehjem或Dounce匀浆器/松型槌；

肝脏组织切成1cm3小块，装入缓冲液中，倒入研磨器离心：第一步：1300g，10min，4°C×3次，沉淀未破碎细胞、细胞核、大片细胞膜和结缔组织纤维；第二步：17000g，15min,4°C×2次，沉淀线粒体。（2）从培养细胞中制备线粒体细胞破碎：匀浆缓冲液（低渗）：10mMNaCl