杨树基因标记的研究进展

杨树基因标记的研究进展

杨树科和杨树科共有100多种植物分布在欧洲、美国和亚洲。它们是保护森林、水土保护林、绿树和人类工林公石的重要树种。近年来，森林科学家对生理生化、解剖构造等基本资料进行了深入研究，对促进柳树遗传改良产生了重大影响。然而，传统育种中的抗病、抗虫性、性别决定和早期造林选择等问题并不能从根本上解决。因此，应尽快研究杨树的生物学。杨树种间杂交和无性繁殖容易,杨属所有种的染色体数均为2n=38,核基因组相对较小(2c=1.1~1.2pg),便于遗传操作,并已建立较完善的遗传转化体系,获得了转基因植株.因此,杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种.由于杨树种间杂交容易,在F1代有很强的杂种优势(材积生长量),杂种的F2代在许多性状方面可发生广泛的分离,所以大量的分离群体在F1代或F2代很易建成.十几年来,前人利用分子标记技术对杨树基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量性状基因定位.在杨树中,常用的分子标记为RFLP,RAPD和AFLP,它们是继形态标记(Morphologicalmarkers)、细胞学标记(Cytologicalmarkers)和生化标记(Biochemicalmarkers)之后发展起来的一种以DNA多态性为基础的新一代遗传标记.与形态标记和生化标记相比,分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的,基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的,在植物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记不受环境影响,其变异只源于等位基因DNA序列的差异,与不良性状无必然的连锁,不需专门创造特殊的遗传材料[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20].基于上述这些优点,分子标记技术可为杨树生产提供准确、可靠的遗传标记.1林分密度标记rflp和双荧光标记rapds分子标记是分子生物学发展的产物.80年代初,发展了RFLP,随后其发展极为迅速,产生了多种分子标记技术,用于杨树遗传育种的主要有以下3种.(1)RFLPRFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)指限制性片段长度多态性,是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记.RFLP在林木遗传育种中的应用是从1986年开始的,迄今也开展了大量的研究.RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小.其基本步骤包括基因组DNA的限制性酶切,电泳分离,利用探针进行Southern杂交来检测基因组DNA.RFLP标记具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图.然而,RFLP必须经过DNA酶切、电泳、Southern杂交,费时、费力、周期长,每次实验检测的位点较少,对DNA需求量较大(5~10μg),需用放射性同位素或非放射性物质标记探针,探针的种属特异性较强,杨树已有的探针不超过300个,这是RFLP应用在杨树中的主要问题.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区(Gaps).(2)RAPDsRAPDs(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs)为随机扩增多态性DNA,是一项基于PCR技术基础之上,用一个随机引物(8~10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[7,8,9,10,11,12,13].与RFLP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DNA用量少,实验设备简单,不需DNA探针;设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好.因此,继RFLP之后,RAPD是在杨树研究中应用最广泛,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,报道最多.但是,RAPD受条件影响很大,因此对设备、条件及超作的要求都很严格,若达不到要求,稳定性和重复性就很难保证,解决的办法是严格控制实验条件,使用相同的PCR仪和引物.(3)AFLPAFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms)扩增片段长度多态性,是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau和Vos发明创造的一种DNA分子标记新技术.其基本原理是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机限制性片段,将特定的接头(adapter)连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3’末端的识别,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环而扩增,最终通过聚丙烯酰胺电泳分子筛作用,将这些特异的限制性片段分离开来.AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起来的.它是RFLP和RAPD的结合,它集中了二者的长处,既有RFLP的可靠性,又有RAPD的方便性.也就是说它不仅具备了其它DNA分子标记技术所具有的特点,多态性丰富,共显性表达,不受环境影响,无复等位效应,而且还具有带纹丰富,用样量少,灵敏度高,快速高效等特殊优点.通过一些实验室和科学家的使用和验证,AFLP被认为是一种十分理想的、有效的分子标记技术,它可以在短时间内提供巨大的信息量.尽管它产生时间还不长,即在林木指纹图谱技术、遗传图谱构建中使用很广泛,预计AFLP在杨树分子育种中将发挥更大的作用.其缺点为:实验成本较高,基因组的不完全酶切影响实验结果,所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高,同时要求实验人员有很高的操作技能.2分子标记在遗传育种中的应用作为一种有效的遗传标记,分子标记直接以DNA为研究对象,在杨树遗传育种方面应用广泛,分子标记在无性系指纹图谱构建、遗传图谱构建和数量性状基因定位中研究进展较快,这些开创性工作为杨树育种,利用分子标记进行辅助选择奠定了必要的理论基础.2.1rapd指纹图谱的建立指纹图谱(Fingerprinting)是鉴别品种、品系和无性系(包括杂交亲本和自交系)的有力工具.90年代以前,指纹图谱构建主要是同工酶方法,而目前主要是DNA水平的分子标记技术.由于杨树分布广,在长期的自然演化和种间杂交过程中形成了生态适应性各异、数量庞大的一些变异的新种和新的无性系,为了正确地保护和利用遗传资源,应利用分子标记技术对杨树无性系鉴定进行研究,以便于在世界范围内广泛交流,为充分利用这些无性系提供一个可靠的依据.分子标记最为直接的应用是对单株进行指纹分析,最早是利用RAPD技术进行无性系指纹图谱构建.S.Castiglione等人(1993)利用RAPD标记,对杨属不同种的32个无性系,进行了分析,共用18个引物并从中筛选出4个引物用于PCR扩增反应来区分这些无性系,它们共扩增出120个不同的DNA带,其中多态带占92%,通过统计分析来确定遗传关系,证明即使在形态和物候基础上不能识别的无性系,利用RAPD技术仍可鉴别出来,该研究指出,生长在不同地点的同一无性系植株其指纹没有差异.Silvia,Cortizo等人(1996)用RAPD标记技术对广泛种植在阿根廷的12种美洲黑杨进行无性系鉴定,结果表明:那些从形态上难以分辨的无性系,用RAPD标记可以对这些无性系进行区分;随后,N.Sanchez等人利用RAPD标记对黑杨(P.nigra.)、美洲黑杨(P.deltoides)、银白杨(P.alba)、欧洲山杨(P.tremula)、毛果杨(P.trichocarpa)25个无性系进行了鉴定,他们发现每个种及每个种内的无性系所表现出的RAPD带都不一样,从而根据这些谱带来区分杨属不同种;尹佟明等人(1998)首次把AFLP标记用于杨属指纹图谱构建中,他们使用两个引物组合(E-ACA和M-CAG;E-AAC和M-ACT)构建了美洲黑杨42个无性系的AFLP指纹图谱,每个无性系的扩增谱带数都在50条以上,扩增片段大小在0.3~1.5kb之间.由于这些材料亲缘关系较近,大多数多态谱带不仅对某一无性系特异,但就对每一无性系而言,这些多态谱带构成了每一无性系的特征谱带组合,根据每一无性系的特征谱带组合,可以鉴别不同的无性系.2.2分子标记连锁图谱遗传图谱的构建是基因组研究中的最基础的工作,可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究奠定基础.构建遗传图谱,需要适当的分离群体和家系,还需要大量能揭示亲本多态性的遗传标记.随着以RFLP为代表的分子标记的出现,遗传作图在许多林木中得到了飞速发展.国际上已有20多个国家开展了30多个树种的遗传图谱构建和数量性状基因位点的定位研究.杨树的遗传图谱构建起步虽较晚,进展相当迅速,但由于杨树是林木遗传研究的模式树种,其遗传图谱的构建具有重要的理论意义和应用前景.第一个用分子标记进行杨树遗传图谱构建的是Minnesota大学的Liu和Furnier,他们(1993)以美洲山杨(P.tremuloidesMichx)5个全同胞家系为材料利用RFLP标记和等位酶标记构建了世界上第一张杨树遗传图谱,该图谱包含了54个RFLP标记和3个等位酶标记,形成14个连锁群,覆盖基因组总长约664cM;随后,华盛顿大学的H.D.BradshawJr和M.Villar等(1994)用毛果杨(P.trichocarpa)为母本,美洲黑杨为父本,产生的F2群体为材料,采用了3种不同的分子标记RFLP,STS,RAPD构建了包括343个分子标记的遗传连锁图谱,其中有111个RAPD标记,215个RFLP标记,17个STS标记,估计杨树基因组长度为2400~2800cM,通过连锁分析有312个标记分属于35个不同的连锁群,其中最大的19个连锁群覆盖基因组总长约1261cM,覆盖率为48.5%.我国杨树遗传连锁图谱研究进展较快,南京林业大学与中国科学院遗传研究所合作(1999)利用RAPD标记,以响叶杨(PopulusadenopodaMaxim.)×银白杨(P.albaL.)的F1群体为材料,分别构建了响叶杨和银白杨的分子标记连锁图谱.实验过程中对600个随机的寡核苷酸引物进行了重复筛选,共选出128个引物用于作图群体的随机扩增,作图群体大小为82个单株(包括双亲),结果获得了326个拟测交位点和7个3∶1分离位点,拟测交位点中有238个位点来源于银白杨,有88个位点来源于响叶杨.经偏分离检测,用于银白杨作图的位点共计212个(26个位点偏分离),用于响叶杨作图的位点共计78个(10个位点偏分离).利用多点连锁分析,银白杨中有189个连锁标记构成了20个不同的连锁群,6个三连体和16个连锁对,连锁标记覆盖的总图距为2402.4cM.而响叶杨有41个连锁标记分属于12个不同的连锁群,标记覆盖的总图距为479.4cM,获得了中等密度的银白杨连锁图谱和响叶杨图谱的一个连锁框架.目前国内外在林木遗传图谱研究中,一般采用拟测交策略,即分别构建父本和母本的两张不同的连锁图,它不能把基于不同亲本的连锁图整合到一张图上,主要是因为缺少足够的信息,从而使在亲本1中分离而在亲本2中固定的分子标记不能与在亲本2中分离而在亲本1中固定的分子标记关联起来,而通过那些在双亲中均分离的标记,可以使两张图连结成一体.随后,南京林业大学、中国科学院遗传研究所、美国北卡罗来纳州立大学合作,利用RAPD标记和美洲黑杨×欧美杨(P.euramericana)的F1群体,构建了美洲黑杨×欧美杨的分子标记连锁图谱,作图群体大小为92个,实验过程中对1040个10碱基寡核苷酸随机引物进行了重复筛选,共选出127个引物用于作图群体的随机扩增,这127个引物产生229个多态位点,利用多点连锁分析,形成19个连锁群及6个三连体和14个连锁对.由19个连锁群构成的图谱含标记129个,总图距为1914.2cM,覆盖杨树基因组约73.62%,标记间的平均间距为14.84cM,该研究获得了中等密度的美洲黑杨×欧美杨的一个连锁框架.在该研究中,此类型的基因位点较多说明了“三交”(Tripcross)群体在分离位点的显示效率以检测复等位基因分离方面具有高效性.中国林业科学研究院与英国牛津大学合作,利用RAPD方法,在美洲黑杨×青杨(P.cathayanaRehd.)3代谱系中分析分子标记,构建出美洲黑杨×青杨分子标记连锁图谱,该图谱由20个连锁群,110个RAPD标记组成.总图距为覆盖基因组总长度的70.35%,标记间的平均间距为17.27cM.该图谱为杨树抗病虫和其它性状基因定位提供了框架结构,为实现杨树分子遗传育种迈进了最重要的一步.随着多种遗传标记方法的逐步完善和发展,人们正在努力探索应用多种分子标记进行基因组研究.随着林木遗传图谱构建的深入研究,构建出高密度的遗传图谱及对目的基因进行定位,其使用价值将日益提高,使用范围也将不断扩大,将对林木遗传育种产生深远的影响.2.3苗木生长和苗木生长中的qp分子标记的应用利用分子标记技术对林木遗传育种进行研究,一个重要方面是数量性状基因定位(简称QTLs定位).QTLs定位,是阐明控制有关数量性状的主要基因数目,这些基因在染色体上的位置,以及其自效应和联合效应的遗传图.利用这种遗传图和分子标记技术,可使林木育种从表型选择逐步过渡到基因型选择,进一步利用QTLs定位的成果进行标记辅助选择,大大提高育种效率.林木的QTLs定位研究是在农作物已开展QTLs探测之后开始的,并取得了较大的进展.目前,在QTLs作图中较常用的方法为方差分析法(Analysisofvariance,ANOVA)、区间作图法(Intervalmapping,IM)和复合区间作图法.杨树的QTLs定位工作主要集中于重要的经济性状,如生长、材性和抗性等.如美国华盛顿大学Bradshaw等人(1995)通过对毛果杨×美洲黑杨的F1群体遗传图谱的构建,利用连锁图上的分子标记对树高、胸径、材积、干形和分枝角等重要经济性状进行了QTLs定位研究,发现这些数量性状变异的25%~96%是受1~5个QTLs控制的.例如苗木2年生时材积生长性状的大部分变异是受4个QTLs控制(它们所控制的变异分量分别占遗传变异的85%,占表型变异的49%),其中的3个QTLs为显性方式遗传,第4个QTLs呈超显性遗传.研究也表明,控制高生长的等位位点在毛果杨上是纯合的,控制粗生长的等位位点在美洲黑杨上是纯合的.研究还发现,QTLs可能在苗期和以后的生长期中有所变化,因此可根据QTLs作用随时间的变化来预测林木的生长过程.中国林业科学研究院的李金花等人(1999)以美洲黑杨(母本)和青杨(父本)杂交获得的F2群体80株为材料,应用RAPD标记检测与F2群体3个数量性状(苗高、地径和封顶期)有关的QTLs,研究表明:①该研究检测出分别与苗高、地径和封顶期关联的7,6和3个标记座位,其联合贡献率分别高达45.94%,41.17%,19.13%,但各标记座位对性状的贡献率较小,表明其均为微效基因.②用单因子方差分析检测到与封顶期性状关联的RPL05-3与苗高性状不关联,但双因素方差分析检测发现,其分别与RPN04-2和RPH01-1的互作与苗高性状相关联,且互作对苗高的作用微小.大量研究证明林木叶片对林木生长量的重要性.经典数量遗传学研究表明F2代叶片数量性状间存在显著相关性,但无法鉴别数量性状基因在染色体上的位置及其遗传效应,也难以确定相关性状的QTLs间的关系.分子标记技术的出现,使得对林木叶片数量性状研究进入到分子水平阶段.美国的R.Wu和华盛顿大学的H.D.Bradshaw等人通过分子标记和数量遗传方法以毛果杨×美洲黑杨种间杂交谱系为基础,研究发现叶子色素、叶柄长和叶长比率受少数QTLs控制,并指出父母本毛果杨和美洲黑杨对于它们的杂交子代表型有不同的贡献,例如控制叶缘绿色和叶柄的扁平程度的基因位点主要由美洲黑杨控制,而控制叶脉着生方向和叶片角度基因位点主要由毛果杨控制.又如中国林业科学研究院的苏晓华等人(2000)利用数量遗传学和RAPD标记相结合,对美洲黑杨与青杨杂交产生的F2群体5个叶片数量性状进行了相关联标记及其图谱定位研究.用单因素方差分析检测出与叶长、叶宽、叶长/叶宽、叶柄长和叶面积相关联的RAPD标记分别为10,10,4,9,12个;联合贡献率分别为66.23%,61.82%,32.86%,59.67%,81.79%.用双因素方差分析检测出与互作QTLs紧密相关联的标记位点共19对,其中与叶长、叶宽、叶长/叶宽、叶柄长和叶面积显著相关联标记分别有4对、2对、1对、5对、7对.与这5个性状相关联的标记多数集中分布于第4,12,15和17条连锁群上.这些研究的目的是为实现杨树分子标记辅助选择育种提供依据和参考,有助于林木生长量的改良.2.4基于近等基因系的rapd分析标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)或称标记辅助育种,是指通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记判断目标基因是否存在.根据连锁图将目标基因定位在某一染色体上,就可选择分散在染色体上不同位点的标记并逐渐逼近,这样便很快找到该基因的分子标记.林木遗传图谱为在DNA水平上进行林木生长、材性和抗性等重要性状的早期测定提供了依据,同时也提高了早期测定的精确度和可靠性,从而大大缩短了林木育种周期.在实际育种工作中,首先要确定目标性状是由质量性状或QTLs控制,利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记,是进行质量性状选择的有效途径.林木中,标记目标性状基因的方法目前主要有两种:一是利用近等基因系或Michelmore(1991)等提出的分离群体分组分析法(BulkedSegregantAnalysis,BSA),BSA是将F2分离群体中研究的目标性状根据其表型(如抗病、感病)分成两组,将每组内的一定数量的植株的DNA混合,形成按表型区分的DNA池,也称近等基因系(IsogenicDNAPools),并用作模板进行RAPD分析.二是利用已有的连锁图进行标记.在杨树基因定位中主要是采用BSA法,例如M.T.Cervera等以美洲黑杨×黑杨的F1代的叶片为材料,利用A