炮制时间对制乌头中5种化学成分的影响

炮制时间对制乌头中5种化学成分的影响

何首乌最初出现在开宝草本植物中。这是蓼科植物的干燥部位。它可以解毒、消除邪气、润肠排便。产品具有补肝、肾、精血、乌须发等功效。《中国药典》和《全国中药炮制规范》对何首乌炮制时间未做明确规定,课题组采用大鼠血虚动物模型,证明采用传统方法炮制24,32,40h的炮制品醇提液显示一定的补血功效,生首乌和72h炮制品醇提液则未显示出补血功效。何首乌主要含2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)、游离蒽醌(如大黄素与大黄素甲醚)等,是目前何首乌质量控制的主要成分,在2010年版《中国药典》中均有含量测定要求。此外,近几年研究发现,何首乌经炮制后可检测到没食子酸、5-羟甲基糠醛(5-HMF)等成分,但是否与其炮制后药效变化相关尚不明确,目前仍缺乏制何首乌饮片有效的质量控制方法。本文采用RP-HPLC法建立制何首乌中没食子酸、5-羟甲基糠(5-HMF)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素与大黄素甲醚的含量测定方法,分析生首乌及其24,32,40,72h的炮制品5种成分的含量变化规律,结合前期药效研究结果,为进一步研究制何首乌饮片质量控制方法提供参考。1材料表面1.1高效液相色谱检测美国Agilent1200型高效液相色谱仪(含在线真空脱气机,高压四元泵,自动进样器,智能化柱温箱,二极管阵列检测器DAD,Agilent1200series色谱工作站;BS224S电子分析天平(Sartorius);USC-702超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司);G20型医用高速离心机(安新县白洋离心机厂);minipore纯水机1.2药品、试剂与仪器没食子酸对照品(批号110831-200302)、5-HMF标准品(批号111626-200402)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号110844-200505)、大黄素对照品(批号0756-9707)与大黄素甲醚对照品(批号110758-200509)均购自中国药品生物制品检定所;其余所用试剂均为色谱纯,水为超纯水。何首乌饮片生品(批号050402)由广东省康美饮片厂提供,产地为广东德庆,原药材经该厂质检部鉴定为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb的块根。制首乌饮片由本实验室人员在康美饮片厂炮制,采用传统炮制方法,将润透后的生药置笼屉蒸,分别蒸制24,32,40,72h,低温烘干。2方法和结果2.1检测波长和方法色谱柱为PhenomenexKinetexTMC18(4.6mm×100mm,2.6μm);流动相A为乙腈,B为0.5%乙酸,梯度洗脱(0~7min,2%~3%A,98%~97%B;7~18min,3%~28%A,97%~72%B;18~24min,28%~55%A,72%~45%B;24~36min,55%~95%A,45%~5%B);流速1.8mL·min-1,柱温30℃,DAD全波长扫描范围为190~400nm,检测波长没食子酸270nm、5-HMF284nm、二苯乙烯苷320nm、大黄素和大黄素甲醚254nm;进样量5μL。对照品与供试品色谱图分别见图1,2。2.2对照品溶液的配制分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷与大黄素对照品适量,置于100mL量瓶中,加80%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别配制成117.0,107.0,107.0,123.0mg·L-1对照品溶液;精密称取大黄素甲醚对照品适量,置于100mL量瓶中,加80%甲醇适量,超声10min,超声后冷却至室温,80%甲醇补足至刻度,摇匀,精密移取2.87mL置于10mL量瓶中,加80%甲醇溶解并稀释至刻度,配制成33.84mg·L-1大黄素甲醚对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取制何首乌细粉约0.25g,精密称定,置于100mL量瓶中,加入80%甲醇适量,静置30min后,超声提取20min,超声后冷却至室温,80%甲醇补足至刻度,摇匀,10000r·min-1离心3min,吸取上清液,0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液为供试品溶液。2.4高效液相色谱法精密移取5种对照品溶液,分别用80%甲醇配制成6个不同质量浓度,见表1,按2.1项下色谱条件,分别取系列质量浓度的没食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品溶液注入高效液相色谱仪,测定峰面积值;由于所考察的对照品溶液线性范围较广,采取以对照品溶液浓度(mg·L-1)为自变量(X),色谱峰面积为因变量(Y),利用Excel数据处理软件进行最小二乘法回归分析,得到斜率与截距,其回归方程式与相关系数(r)如表2所示,5个成分均呈良好线性关系。2.5仪器精密度试验按2.1项下色谱条件,分别取没食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黄素与大黄素甲醚对照品溶液连续进样6次,测定并计算5种成分峰面积值RSD分别为1.45%,0.42%,0.34%,0.92%,1.45%,表明仪器精密度良好。2.6稳定性试验按2.1项下色谱条件,取同一供试品溶液,分别在制备后的2,4,6,8,12,24h注入高效液相色谱仪,测定5种成分峰面积RSD分别为1.64%,0.63%,0.52%,0.74%,1.25%,表明供试品溶液中5种成分在24h之内保持稳定。2.7重复性试验的考察取同一批次何首乌样品6份,每份约0.25g,精密称定,分别按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定,计算没食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黄素与大黄素甲醚的含量,RSD分别为0.58%,0.68%,0.46%,0.37%,0.15%(n=6),表明该法重复性良好。2.8对照品溶液制备称取已知5种成分含量的制何首乌饮片细粉约0.25g,精密称定。另取5种对照品用80%甲醇配制成低、中、高3种质量浓度的混合对照品溶液,分别含没食子酸32.33,40.42,55.50mg·L-1;5-HMF7.800,8.520,11.10mg·L-1;二苯乙烯苷146.0,220.9,419.8mg·L-1;大黄素31.82,45.46,78.84mg·L-1;大黄素甲醚8.920,17.44,23.16mg·L-1。精密移取混合对照品溶液10mL加至样品中,各成分对照品加入量与样品中的含量比例约为1∶1。按照2.3项下方法制备,每个浓度平行操作3份。按2.1项下色谱条件分别测定5种成分含量,并计算加样回收率,结果见表3。2.9测定总成成元含量的测定取1.2项下何首乌和制何首乌各样品细粉约0.5g,精密称定,按2.3项下供试品溶液制备方法制备,按2.1项下色谱条件进样,测定5种成分的含量,测定结果分别见表4。3讨论3.1提取效率的提高比较了两种提取方法的提取效率,结果发现80%甲醇超声提取20min所得5种成分含量较高(没食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黄素与大黄素甲醚含量分别为0.1543%,0.03752%,1.932%,0.1849%,0.05668%),大于80%乙醇回流提取2h得到的含量(含量分别为0.1309%,0.03763%,1.523%,0.09052%,0.02773%),效率显著提高。3.2回收率及色谱条件应用了具有超高效、低背压性能的新型色谱柱,采用1.8mL·min-1的流速,检测时间36min,比常规C18色谱柱(约需70min)大大节省分析时间,从而显著提高了分析效率,且结果准确,重复性良好,也为(制)何首乌质量标准研究提供了一种快捷的分析方法。3.33号峰的评估3.4样品的制备及检测何首乌所含的鞣质类物质经加热后水解,制首乌中没食子酸的含量比生首乌显著升高,但炮制至24h后,其含量变化较为稳定;5-HMF为炮制后新产生的成分,其含量随着炮制时间的延长而增加;大黄素和大黄素甲醚炮制后含量升高,以32h炮制品含量最高,之后则呈现下降的趋势;二苯乙烯苷的含量则随着炮制时间的延长呈下降趋势,按照2010年版《中国药典》规定,制首乌二苯乙烯苷含量应不低于0.7%,即7mg·g-1,本实验按传统炮制方法清蒸32,40,72h样品的二苯乙烯苷含量均低于0.7%,而前期的药效学研究表明,24,32,40h的制首乌均有改善大鼠贫血模型指标的作用。因此,制首乌补血功效与其主要化学成分之间的相关性及量效关系有待进一步深入的研究。采用乙腈-0.5%乙酸体系进行梯度洗脱,所测5种成分得到有效的分离,采用LC-MS(ThermoScientificLTQOrb