低反射神经源性膀胱大鼠模型的建立

低反射神经源性膀胱大鼠模型的建立

低反射神经源性膀胱（iud）也称为低反射神经过渡，通常罕见。国际尿控协会(InternationalContinenceSociety,ICS)(2002)将DU定义为:逼尿肌收缩力和/或收缩持续时间的降低所导致的膀胱排空的延迟和/或一定时间内不能获得膀胱完全排空。目前人们在DU的病理改变、诊断标准及治疗方法的研究上仍无明显进展。由于目前尚无一种可靠的、可重复的建立DU动物模型的方法,阻碍了对此疾病的进一步研究。本实验采用手术方法于第4～5腰椎间隙水平完全离断大鼠脊髓圆锥,造成大鼠骶下神经损伤,成功制备DU大鼠模型,现报告如下。1材料和方法1.1实验组的制备选择健康Wistar雌性大鼠40只,体重200～220g,随机取10只作为正常对照组,余30只为实验组。大鼠由北京华阜康生物科技公司提供。1.2麻醉成功标准10%水合氯醛(体积分数)腹腔麻醉(3mL/kg),当大鼠角膜反射、夹尾反射均消失为麻醉成功标准,麻醉成功后将大鼠俯卧于鼠板上,固定四肢。1.3腰椎板下腔内固定取大鼠背部正中切口长约3cm,向上、向下游离皮下组织。触摸定位第13肋,解剖暴露第13肋,与其相连椎间隙为T13～L1间隙。沿L1椎体下数4个间隙至L4～5腰椎间隙水平。解剖游离椎板周围肌肉组织暴露椎板。咬骨钳破坏椎板,暴露脊髓。眼科镊小心提起脊髓并予离断,离断后取周围肌肉组织填塞于脊髓断端之间,逐层缝合肌肉、皮肤。按压大鼠下腹部排空膀胱。正常对照组10只,假手术,只行椎板切除,不离断脊髓和圆锥。1.4术后辅助材料术后给予庆大霉素腹腔注射预防感染,并观察大鼠四肢运动情况,我们认为如大鼠后肢为膝行,只有前肢参与行走,即是脊髓完全离断的标志。术后每日按压下腹部2次协助排尿、排便,按压大鼠下腹部并用量杯准确记录每次残余尿量。并观察大鼠四肢有无溃烂、自嗜肢体等现象。1.5水合氯醛麻醉后阴道形态检测手术后6周进行大鼠尿动力学检测。尿动力学仪器采用MMS公司尿动力学测定系统(MedicalMeasurementSystemsB.V.theNetherlands)。10%水合氯醛腹腔麻醉(3mL/kg),麻醉后轻压大鼠下腹部,排空膀胱尿液,后将大鼠仰卧位固定于鼠板之上。以硬膜外导管经尿道插入膀胱,导管经三通管与尿动力仪及微量灌注泵相连。生理盐水以0.2mL/min的速度灌注,行膀胱压力容积测定。测定时观测膀胱漏尿点压力并予以标记,漏尿后继续灌注至逼尿肌压力稳定。膀胱顺应性用膀胱容量增加与逼尿肌压力增加之比表示。1.6方差、方差齐性检验、t检验结果用x¯±sx¯±s表示。数据分析先进行正态性、方差齐性检验,然后再进行t检验(方差不齐时做t′检验)分析。采用SPSS15.0软件处理实验数据,P<0.05认为有显著性差异。2结果2.1一般情况下实验组大鼠30只,2只因麻醉过量死亡,2只在饲养中出现肢体自嗜感染后死亡。其余均存活。对照组大鼠10只均正常存活。2.2残余尿量持续下降手术组大鼠在手术后即出现尿潴留,约第2天时残余尿达顶峰,然后残余尿量持续下降,下降约持续10d,10d后残余尿量趋平稳,术后10d内尿量为(2.09±1.05)mL,10d后尿量为(0.67±0.21)mL。2.3大鼠灌注量、漏尿点逼尿肌压力、顺应性变化情况行大鼠膀胱压力容积测定,获得压力容积曲线,进一步行统计学分析:实验组大鼠灌注量高于正常对照组(P<0.001),漏尿点逼尿肌压力低于正常对照组(P<0.01),膀胱顺应性高于正常对照组(P<0.05,表1)。3du动物模型的制备DU的发生是多因素的,老龄可造成逼尿肌功能的减退,而代谢性疾病及神经性疾病亦可造成逼尿肌功能的减退。尿动力学数据表明DU的产生多与年龄相关。大于60岁的男性及女性中存在膀胱排空障碍的分别为22.1%及10.8%,逼尿收缩功能减退可能是主要原因。DU在神经源性膀胱患者中十分常见,如多发性硬化帕金森综合症、糖尿病脑卒中等均可出现DU。DU同样也能因医源性神经损伤引发,如腹腔镜前列腺切除术、子宫切除术等盆腔的手术。研究发现造成DU的主要病理生理改变有两种:肌源性和神经源性。在肌源性学说中研究发现年龄正常的DU患者逼尿肌收缩力下降,糖尿病膀胱逼尿肌也出现了此种改变。收缩力的降低可能与胶原蛋白、胆碱能受体分布密度、肌细胞间隙增宽及循环系统去甲肾上腺素的分泌等相关。神经源性学说将DU分为3类:排尿反射传出神经的病变、启动反射的传入神经病变、排尿中枢以上神经中枢控制能力缺失。排尿反射由脊髓-延髓-脊髓通路控制,包括骶副交感神经核、脑桥排尿中枢及更高层的皮层中枢。排尿反射的激活和维持依靠感觉神经元信息自膀胱向大脑中枢的传递。因此,感觉神经功能障碍可能对DU的产生有一定作用。研究发现年龄增长可导致大脑接受膀胱感觉信号的相关区域反应性降低。在糖尿病患者中,DU与膀胱支配神经传出通路中Aδ及C类神经的损伤有关。尿路上皮受体功能及神经递质的释放等均有可能导致DU。人们一直在探寻一种可重复的、与其发病过程相类似、并可调控的制备DU动物模型的方式。目前所采用的制作神经源性膀胱的方法主要有:①脊髓横断及挫伤。②脊髓以上的神经损伤,如去大脑手术、大脑局部损伤、大脑中动脉栓塞等。③全身药物的应用如环磷酰胺或膀胱内药物的注射如丙烯醛、脂多糖等。以上方法中除脊髓横断及挫伤能够应用于DU模型的制作外,其他方法均不适用。而且由于人们对DU发病机制缺乏完全了解,以及DU的多种致病因素难以模拟,使得人为造成脊髓损伤的方法制备DU动物模型成为首选。自从1911年ALLEN首次建立重物下落打击挫伤模型以来,经过学者们的日臻完善,目前此方法公认为是制作大鼠脊髓损伤的主要方法。然而此种方法并没有进一步的临床数据,而且存在部分动物术后脊髓功能恢复的情况,因此并不是一个完美的模型制作方法。1987年BREGMAN研究出了通过完全横断脊髓建立动物模型的方法,并获得了一定的实验数据。但由于膀胱过度活动症(overactivivebladder,OAB)与DU产生的脊髓节段的差异及人们对DU产生机理研究的缺乏,此方法尚未应用于DU模型的制作。传统的Aleen法难以保证以上DU发病神经源性三个因素的同时存在,此局限性降低了模型建立的成功率。本研究选择于第4～5腰椎间隙水平完全离断大鼠脊髓圆锥造成大鼠骶下神经损伤,是因为大鼠脊髓圆锥细长,从第1腰椎头侧份平面一直延伸到第4腰椎尾侧份水平,其第1脊髓阶段位于第2腰椎中段水平。因此选择在第4～5腰椎间隙水平离断能够保证大鼠排尿中枢传出及传入通路的完全破坏,这具有其他实验无法比拟的优势。节段过低无法保证脊髓圆锥的完全破坏,而节段过高则可能影响到较高节段的脊髓功能而出现骶上神经损伤。实验组大鼠在术后立即出现尿潴留,尿潴留后尿量变化的曲线符合脊髓损伤休克期及休克后期排尿功能变化的趋势。且本实验未观测到脊髓休克期过后的典型的反射性失禁,这说明对于膀胱支配神经的破坏已经十分完全。根据ICS对于DU的定义:膀胱收缩力的下降及膀胱排空的障碍是DU的两个主要特点。比较两组大鼠尿动力学检测指标发现,手术6周后实验组大鼠膀胱容量明显增加,漏尿点逼尿肌压力降低,膀胱顺应性增大。表明经过6周时间,大鼠逼尿肌收缩功能明显减退,在膀胱充盈时无法有效地收缩排尿。比较两组大鼠尿动力膀胱测压图形发现实验组大鼠膀胱容量明显增大,逼尿肌压力随着容量的增大未见明显变化并且未产生排尿,这表明手术造成大鼠膀胱传入神经功能障碍,无有效传入信号启动排尿反射,造成膀胱排空障碍。这符合临床低反