盐酸克伦特罗致人体尿样检测阳性的可能性

盐酸克伦特罗致人体尿样检测阳性的可能性

盐酸克伦特罗（clenbuterol）的化学特征为2-[（叔叔氨基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，商品名称为克哮喘素和哮喘素，是合成2-肾上腺受体激动剂。其药理作用为松弛支气管平滑肌、增加肺活量、降低气道阻力、增强支气管纤毛运动和促进痰液排出,临床上常用于防治哮喘、肺气肿等呼吸系统疾病。除具有以上药理作用外,克伦特罗还具有蛋白同化作用,因此作为兴奋剂,该药物是世界反兴奋剂机构(WorldAnti-DopingAgency,WADA)禁止运动员使用的一种蛋白同化制剂。近年来,盐酸克伦特罗被非法用于饲养生猪,俗称“瘦肉精”,其蛋白同化作用可促进动物肌肉生长,降低脂肪量,并在被饲养动物的肌肉组织和内脏中残留。盐酸克伦特罗化学结构相对稳定,在体内不易被破坏分解。含有该药的肉类经过126℃油煎5min,只能破坏一半残留量,常规烹调对克伦特罗残留起不到破坏作用。如果运动员食用了残留盐酸克伦特罗的猪肉或猪内脏,甚至有可能造成尿检阳性,这将严重影响运动员的运动生涯。本实验从对生猪进行不同方法定量添加盐酸克伦特罗饲养开始,定量分析饲养的生猪各部位组织残留的克伦特罗,接着对健康受试者进行定量食用烹饪熟的猪肉组织的人体受试研究,最后分析总结食源性盐酸克伦特罗造成人体尿样兴奋剂阳性的可能性,为探讨运动员是否会由于食用盐酸克伦特罗喂养过的猪肉或猪内脏造成尿检兴奋剂阳性的可能性提供数据支持。1材料和方法1.1化学试剂及试剂盐酸克伦特罗对照品(中国药品生物制品检定所);纳多洛尔和甲基睾酮(Sigma公司);高氯酸(上海金鹿化工有限公司);氨水(北京化工厂);甲酸(Dikma);氢氧化钠(北京化学试剂公司);甲酸铵(国药集团化学试剂有限公司);甲酸(Dikma);乙腈(Dikma);HLB固相萃取小柱(Waters);MCX固相萃取小柱(Waters);叔丁基甲醚(Dikma);β-葡萄糖醛酸甙酶(Sigma);磷酸氢二钾(北京化学试剂公司);磷酸二氢钾(北京化学试剂公司);碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司);碳酸氢钠(国药集团化学试剂有限公司);三甲基碘硅烷(Sigma)。1.2设备和其他设备1.3采集条件水气流量a流动相为10mmol·L-1pH3.5甲酸铵(A)和乙腈(B),洗脱梯度为0min时A90%,2min时A90%,11min时A25%;流速为0.4ml·min-1;进样量为20μl;扫描方式为选择离子采集方式采集m/z277(克伦特罗)和m/z310(内标);干燥气流速为9L·min-1;雾化气压力位40psi;柱温为40℃。1.4猪仔的饲养方式委托北京黎昌钰鑫科技发展有限公司按不同剂量盐酸克伦特罗和不同养殖周期专人单独饲养6头猪仔,饲养方式见表1。饲养到期后在屠宰场宰杀,取每头猪前腿、后腿、里脊、腹肉、肝脏和肾脏六个部位部分组织冷藏。1.5提取产物的纯化提取:准确称取10.0g样品,加入10ml水,匀浆约1min,用高氯酸调pH值至1.0,超声振荡20min。取上清液于干净试管中,残渣再用0.1mol·L-1高氯酸溶液10ml提取一次,离心,合并上清液。用12mol·L-1氢氧化钠溶液调pH值至4.0,此溶液待过HLB固相萃取小柱。净化:HLB固相萃取小柱在使用前用6ml甲醇、6ml水活化。将提取液以2ml·min-1的速度过柱,弃去滤液,用5%甲醇氨2ml淋洗,小柱抽干。再用6ml甲醇洗脱。洗脱液用氮气吹至近干。用0.1mmoL·L-1高氯酸溶液3ml溶解残渣,供MCX柱净化用。MCX柱在使用前用3ml5%甲醇氨、3ml甲醇、3ml水、3ml0.1mmoL·L-1高氯酸溶液活化。将净化后的溶液过柱,弃去滤液,依次用1ml甲醇、1ml2%甲醇水溶液淋洗,最后用5%甲醇氨7ml洗脱,洗脱液用氮气吹至近干,用1ml初始比例流动相溶解,用于LC/MS测定。1.6单次定量受试者受害者两名健康男性受试者,体重分别为85kg(一号受试者)和65kg(二号受试者)。人体受试前均已签订《知情同意书》。对已知盐酸克伦特罗含量的一定重量猪肉或猪肝进行正常烹饪至熟,然后分别对两名受试者进行单次定量受试。受试者留取3天内所有尿样,在受试期间正常饮水但不能再食用其他肉制品。1.7-甲基-4-甲基甲基-4-甲基甲基甲基苯磺酸酯3-甲基甲基碘甲基3-甲基甲基,4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基甲基,5-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基甲基甲基,5-甲基-4-甲基-5-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基甲基,5-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基甲基甲基甲基,5-甲基-5-甲基-5-甲基-5-甲基-5-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-5-甲基-5-甲基-5-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4-甲基-4取尿样2ml加入50μl内标(甲基睾酮,50ng·ml-1)甲醇溶液,加入1ml磷酸缓冲液(pH约为6.9),加入50μlβ-葡萄糖醛酸甙酶(2500unit),55℃恒温水浴保温不少于60min,取出样品冷却至室温,加入0.5ml碱性缓冲液(pH约为9.6),加入4ml叔丁基甲醚,振荡萃取,离心后取上清液,55℃下氮气吹干,加入50μl三甲基碘硅烷,振摇后转移至尖底小瓶中封口,70℃恒温30min,GC/MS分析。2结果与分析2.1提取净化和定量离子分析取空白基质10.0g三份,分别加入10ng·μl-1盐酸克伦特罗对照品100μl,再分别加入10ng·μl-1内标50μl,按照“1.5猪肌肉组织样品的提取与净化”进行提取净化后,氮气吹干,1ml初始比例流动相溶解后进行LC/MS分析,记录克伦特罗的定量离子色谱峰面积(A1)和纳多洛尔(内标)的定量离子色谱峰面积(AIS1)。另取相同空白基质10.0g,按照“猪肌肉组织样品的提取与净化”进行提取净化,提取液中分别加入与上述等量的对照品和内标,氮气吹干,1ml初始比例流动相溶解后进行LC/MS分析,记录克伦特罗的定量离子色谱峰面积(A2)和纳多洛尔(内标)的定量离子色谱峰面积(AIS2)。按下式计算克伦特罗分别在猪肉和猪肝中的提取回收率(E)。E(%)=(A1/AIS1)/(A2/AIS2)×100%。结果见表2。2.2克伦特罗残留量的测定分别以空白猪肉和空白猪肝为基质,建立标准曲线。称取10.0g空白猪肉6份,分别制备成含有盐酸克伦特罗的对照品50ng·g-1、100ng·g-1、200ng·g-1、500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1和100ng·g-1纳多洛尔(内标)对照品的样品,每一浓度点平行做三份,按“猪肌肉组织样品的提取与净化”方法进行前处理,计算克伦特罗提取离子的峰面积与内标提取离子的峰面积的比值,所得标准曲线为y=0.0026x+0.2205,R2=0.996,结果表明在猪肉基质中,盐酸克伦特罗在50ng·g-1~2000ng·g-1范围内线性关系良好,见图1。称取10.0g空白猪肝六份,分别制备成含有盐酸克伦特罗对照品500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1、5000ng·g-1、8000ng·g-1、10000ng·g-1和100ng·g-1纳多洛尔(内标)对照品的样品,每一浓度点平行做三份,按“猪肌肉组织样品的提取与净化”方法进行前处理,计算克伦特罗提取离子的峰面积与内标提取离子的峰面积的比值,所得标准曲线为y=0.0008x+0.5413,R2=0.9951,结果表明在猪肝基质中,盐酸克伦特罗在500ng·g-1~10000ng·g-1范围内线性关系良好,见图2。对受试六头猪的六个部位组织克伦特罗残留量定量分析结果见表3。结果表明:(1)猪肉前腿、后腿、腹肉和里脊的克伦特罗含量无明显差异;(2)肝脏和肾脏克伦特罗含量明显高于前腿、后腿、腹肉和里脊;(3)从猪受试药量与其组织中残留药量的关系可以得出,猪肉克伦特罗残留量与其受试剂量及受试时间长短呈正相关。2.3尿样代谢差别为了考察食用动物肌肉组织和直接服用对照品的尿样代谢差别,本实验两位受试者又同时服用了与猪肝中盐酸克伦特罗等量的对照品,留取尿样进行检测,具体受试信息见表4。3克伦特罗尿检阳性测定从上述人体受试后的尿样检测结果可以得出:两位受试者在正常饮水的情况下,如果食用猪肉制品中克伦特罗总量不超过1μg,则不会产生兴奋剂尿检阳性。但服用残留一定量克伦特罗的动物组织时,可能导致克伦特罗尿检阳性。服用一定量对照