林木microrna研究进展

林木microrna研究进展

0mirna的研究作为2002年科学发现的第一名科学家，纳米颗粒是生物研究的焦点。microRNA(miRNA)是指长度为20~24nt的非编码调控单链小分子RNA,由一段具有发夹环结构的长度为70~80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。这些小RNA能够与特定的目标mRNA的3’端非编码区域互补匹配,进而起到转录后基因沉默和染色质修饰的作用。1993年Lee等在秀丽线虫中发现了一个不编码蛋白质但在线虫发育转变过程中起到重要作用的小RNA分子,这是发现的第1个miRNA。随后几年的研究发现,miRNA是stRNA中的一个大家族,并且很容易在线虫、果蝇、植物、哺乳动物中找到。miRNA的功能也并不局限于发育调节,相反miRNA参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化等。miRNA已成为植物分子生物学领域研究热点之一,相对于模式草本植物拟南芥、水稻等,有关林木miRNA的研究起步较晚。但miRNA应用于林木的遗传改良已有成功的报道。测序技术日益发展使基因数据库或者转录组数据库的充实,为miRNA的挖掘和功能研究提供了有利的数据支持。研究人员在越来越多的树种中开展了miRNA研究,例如:杨属中的毛果杨、胡杨、毛白杨、杂交杨;果树中的柑橘、苹果、桃、梨;经济林木中的桉树、茶树、橡胶树、麻疯树;抗逆林木中的沙冬青;裸子植物中的云杉和松树。科学家们除了挖掘其中丰富的miRNA资源以外,还对一些miRNA的功能做了深入的挖掘。但是对于庞大的林木基因库来说,目前miRNA功能验证的研究只是沧海一粟,许多miRNA的功能还是假定的或者未知的。本研究主要综述国内外林木miRNA研究最新进展,提出未来可能的研究趋势,以供相关研究人员参考。1mirna的sna和转录组测序特点Llave等首次描述了植物中RNA沉默是一个外源基因抑制了一个内源基因。2002年,在拟南芥中发现了第1个植物microRNA。随后的发现认为RNA沉默与小分子RNA息息相关,这为研究小干扰RNA敞开了大门。MiRNA的形成是一系列复杂的过程,初始转录物(pri-miRNAs)通过多次裂解(如Dicer类似酶)形成短的双链分子,最后形成成熟的miRNA。成熟的miRNA3’末端甲基化整合到RNA诱导的沉默复合体(RISC),通过抑制翻译或降解目标mRNA起到基因表达的负调控。另一条与miRNA互补链称之为miRNA*随之降解。植物miRNA的鉴定途径一方面是sRNA的cDNA文库测序,另一方面是对EST或全基因组序列进行生物信息学预测。测序技术的进步大大加快了sRNA的发现,基因组和转录组的汇集也有助于miRNA的鉴定。高通量测序也在全基因组的水平上证实了miRNA靶基因的切割位点。植物miRNA的功能研究主要集中在各种胁迫以及各个发育阶段miRNA的表达,树木miRNA的研究也主要聚焦到这些方面。2mirna影响植物响应3.85亿年前,早期木本植物演化阶段,林木就已经成为了地面景观和陆地生命进化的主导者。区分木本植物与草本植物的主要特征是木本植物木材的形成,植株高大,常年生长和能够进入休眠等。千百年来的极端环境下,林木在很长一段时间内必须适应各种生物和非生物胁迫。miRNA参与调控植物响应胁迫的过程以及生长发育过程。林木miRNA已成为林木分子遗传领域研究的热点。2.1mirna的图像表达杨树是速生树种,基因组大小为450Mbp,比其他树种基因组略小,并且杨树在相对短的时间内就可以达到生殖成熟。杨树是一种重要的木本模式生物,在miRNA方面的研究领先其他树种。Sunkar和Zhu首次发现3个杨树的miRNA(miR397a、miR403和miR408),它们和拟南芥miRNA有相似的茎环结构序列。依据毛果杨的基因组注释,并且基于水稻和拟南芥miRNA计算方法可得到毛果杨具有169基因位点的21个miRNA。结合小RNA克隆,计算茎环结构和利用5’race靶标验证,丰富了毛果杨miRNA的数量。Lu等第1次系统挖掘毛果杨的miRNA,从2年生树的次生木质部共获得了21个家族的22个miRNA。其中10个新的miRNA靶基因通过信息学预测和5’race的实验验证,它们参与运输、蛋白修饰、信号转导等。凝胶印迹和实时定量PCR表明大多数miRNA在不同组织或者经受弯压的发育木质部(机械压力)呈现不同的表达模式,这表明这些miRNA与木材张力的形成有关。研究毛果杨miRNA与寒冷、热、干旱、盐和机械损伤等胁迫关系时,共获得27个家族的68个miRNA。在这些miRNA中,其中17个ptcmiRNA是相对保守的,7个家族(miR1444-1450)是毛果杨特有的。从miRNA芯片和定量RT-PCR的结果来看,16个miRNA家族与冷胁迫相关。同一家族的miRNA成员对冷胁迫也呈现不同的应答反应。miRNA对于不同胁迫应答的交叉现象表明miRNA的胁迫应答交织成一个调控网络。Puzey等在研究毛果杨miRNA时对叶、木质部、经机械处理的木质部以及1个顶尖、雄花、雌花、雌芽、雄芽和侧芽的集合的4个样本进行高通量测序。从这些数据中共获得276个miRNA,其中155个是未曾注释过的miRNA,其中大部分是毛果杨特有的。更重要的是这项研究中还发现了一些富集在木质部的miRNA与树木次生生长息息相关。胡杨是非生物胁迫研究的模式材料,它具有抗高盐、高温、干旱的优点。miRNA与胁迫应答有关,科学家也认为胡杨的miRNA与干旱应答有关。Li等用高通量测序结合microRNA芯片技术进一步研究表明胡杨microRNA响应干旱胁迫,共获得38个家族的58个新的miRNA。其中14个新的miRNA通过部分降解法测序进行PARE(RNA末端平行分析法)共获得21个靶基因。该研究表明其中23个miRNA在毛果杨和胡杨之间是保守的,在响应胁迫时表达差异显著,其中9个表达下调,14个表达上调。毛白杨广泛分布于中国的北部干旱地区,具有较高的经济价值。为了更好地研究毛白杨miRNA和水分胁迫的关系,Ren等设计了CK、涝处理和旱处理3组实验组进行高通量测序并结合实时荧光定量实验,共获得36个家族的152个保守的miRNA,8个已知的但非保守的miRNA,54个miRNA家族的64个候选新miRNA。实时定量结果显示其中17个保守的miRNA家族和9个新的miRNA表达具有显著差异,对干旱具有胁迫应答。7个保守的miRNA家族和5个新的miRNA对涝具有胁迫应答性。研究者还发现miRNA和miRNA*在植物胁迫应答过程中都参与了调控作用。对于潜在靶基因的注释发现这些基因编码与胁迫相关的转录因子、酶、信号转导元件等。杂交杨(Populustremula×Populusalba)的茎中,miR166的表达与靶基因PtaHB1基因和次生木质部的发育成反比。PtaHB1编码第Ⅲ类HD-ZIP蛋白,这类蛋白是一类植物特定的转录因子,主要参与表皮和维管束分化。PtaHB1的转录丰度与二次生长和季节变换有紧密联系。Ko等的研究表明,miR166在生长周期起到重要作用,这对林木季节性适应有重要的应用价值。2.2mirna家族在苹果中的表达Song等发现了柑橘的第一个miRNA,此外他还在柑橘的EST序列中发现了27个与拟南芥一样的保守的miRNA。现有的研究发现柑橘和枳的叶子,嫩梢,花,果实和根的一些miRNA都有着不同程度的组织和物种特异表达。基于序列的互补性,预测获得15个miRNA的41个潜在的靶基因,其中4个靶基因的验证是利用5’race方法将靶基因靶定到其切割位点。之后,Song等利用race法研究了9个枳miRNA,并且验证了它们的表达模式。除此以外,通过race法确定了7个miRNA的8个假定靶标。在另一项研究中,Song等通过高通量测序分析了枳花和果实的sRNA文库,共检测获得了42个高度保守的miRNA家族的63条miRNA序列。Song等还挖掘了10个新的miRNA,并且通过qRT-PCR研究了它们在根、茎、叶、花蕾、花和果实的表达。有关苹果miRNA的研究目前只有有限的3项报道。Gleave等对EST数据库进行分析,鉴定出7个保守的miRNA家族。Northern杂交认定了这些miRNA确实存在于苹果组织中。一些miRNA在花蕾、果实、真菌感染苗的叶子、组培植株的苗和根等呈现阻抑型表达模式,而另一些miRNA在不同组织或被真菌诱导的植株中选择性的表达。已分析获得6个miRNA家族的潜在靶基因的EST序列,其中2个靶mRNA的裂解已经通过5’race的验证。Yu等分析了苹果EST数据库,获得了属于16个家族的31个miRNA。通过miR-RACE和qRT-PCR验证得到16个保守的miRNA(来自不同家族)。如同杨树和拟南芥同源基因一样,16个miRNA的大部分在所有检测组织中都能表达(幼嫩和老叶,幼茎,花蕾,花,发育的果实),而其余的miRNA在组织和发育阶段呈现特定表达。此外,还获得56个潜在靶基因,其中包括一些转录因子mRNA。Varkonyi-Gasic等用Northern杂交和原位杂交检测了苹果21个miRNA的表达模式,其中18个miRNA至少能在一种以上的组织(茎尖,叶,茎,周皮,韧皮部和木质部)中表达,17个在韧皮部都有表达,在筛管分子和韧皮部能广泛表达的至少有8个miRNA,这表明miRNA具有远距离信号指示作用。RT-PCR结果显示6个miRNA与其靶mRNA之间呈负相关性。miRNA的大范围的信号传导对于树木来说十分重要。桃是蔷薇科木本植物,一种新确定的遗传学模式材料梨的miRNA研究并不多,Niu等利用高通量测序在梨树中共挖掘获得37个家族的186个新的miRNA。2009年葡萄miRNA的研究中,Erica等利用寡核苷酸阵列法检测了葡萄不同组织和葡萄成熟过程中miRNA的差异表达。2.3茶树mirna的生物生态学研究在巨桉中获得5个家族的20个保守的miRNA(在其他物种已经检测到),8个家族的28个新的miRNA。利用拟南芥和杨树的基因组作为参照,通过生物信息学预测共获得110个转录本,这些基因涵盖许多功能。qRT-PCR分析揭示11个家族的miRNA在木质部和非木质部组织中呈现不同的表达水平。MiRNAegr-miR90仅在叶片中检测到,而egr-miR359仅在韧皮部检测到。2009年,McNair共检测了12个miRNA在正常生长和快速生长桉树中的表达模式,表明了miRNA在正常桉树和应拉木的发育过程中起重要作用。2011年研究者利用高通量测序技术挖掘了包括2个蓝桉基因型的木质部,BRASUZ1桉树的木质部和叶片4个样本的miRNA,获得了大量的miRNA信息。目前研究茶树miRNA的文章仅有1篇,作者基于序列保守性发现了4个miRNA。生物信息学预测其靶基因功能涉及很多方面。Zeng等检测了4个大戟科树种的miRNA,其中包括橡胶树(巴西橡胶树)和麻疯树(麻风树)。用RT-PCR探究了麻疯树和橡胶树39个miRNA的表达规律。2.4绿化种子研究水资源匮乏的今天,尤其是土地沙漠化日益严重的现状,人们对于特有的沙漠植物产生了浓厚的兴趣。笔者课题组采用中国西北部地区强抗旱植物沙冬青,收集它在NCBI数据库的信息以及2012年Zhou等提交的沙冬青干旱相关的转录组的信息,首次建立沙冬青幼苗的对照组和干旱处理组的miRNA文库,挖掘了与抗旱相关的miRNA,深入研究其抗旱机制,揭示其表达规律,这为林木抗逆品种选育提供了丰富的基因资源。2.5mirna家族在裸子植物治疗前后的表达裸子植物与被子植物在分类学上的区别在于种子形成和开花特性的不同。miRNA作为基因调控因子具有广泛作用,可能与裸子植物分化和发育的特有过程相关。有关裸子植物miRNA的研究主要集中在挖掘和功能分析。裸子植物大量EST的收集促进了miRNA的发现。Axtell和Bartel使用阵列杂交技术分析检测了多种植物中与拟南芥同源的miRNA表达模式,其中一半的保守miRNA家族在松针中都能检测到表达。基于EST序列,Zhang等、Wan等鉴定了松科一些物种的有限的保守miRNA,这些物种包括云杉杂交树种(红果云杉×北美云杉)、白云杉、北美云杉、海岸松、火炬松、高山松。一些研究小组已经从裸子植物sRNA文库中鉴定了大量的保守和新的miRNA。基于当前已注册的miRNA数据库(miRBaseRelease16.0),确定裸子植物的miRNA有70个miRNA家族,包括的一些家族似乎是裸子植物特有的。例如,miR946、miR947和miR950存在于挪威云杉和火炬松中,但不存在于任何被子植物。在被子植物中,丰度较大并且介导DNA甲基化和异染色质化是24nt的sRNA。针叶树种具有一种新的DCL蛋白,但是缺少使被子植物中24ntsRNA成熟化的DCL3酶。针叶树不产生显著大量的24ntsRNA,这表明裸子植物和被子植物在sRNA生物合成中有着不同的途径。24ntsRNA和异染色质化的关系可能与序列冗余有关,这暗示着对于裸子植物来说,其不同寻常的较大的基因组的演变,可能存在一种潜在的机制。新近,Zhang等比较了日本落叶松的体胚和小苗的miRNA文库,发现体胚中miRNA的长度倾向于24nt,而小苗中miRNA的长度更加倾向于21nt。基于聚丙烯酰胺的实验结果也确实证实了落叶松能够产生24nt的miRNA。研究发现miRNA的表达模式对应于发育阶段,作者认为这可能和Dicer-like3和RNA依赖的RNA聚合酶2(RDR2)或者RDR6的水平有关,并且是受激素调节的。Zhang等认为在体胚休眠和萌芽阶段的转录和转录后的过程中,miRNA在落叶松和其他裸子植物都有着复杂的基因调控机制。他们猜测可能是ABA调节体胚休眠和萌发过程中sRNA生物合成的表达水平从而改变了sRNA的组分。被子植物和裸子植物miRNA可能与特定的发育阶段有关,或者它们应答于生物或非生物胁迫。Lu等确定了火炬松miRNA与梭形锈病真菌Cronartiumquercuumf.sp.fusiforme感染苗子后形成的虫瘿有关。其中10个miRNA家族在有虫瘿的茎上相较于健康的CK的表达有着显著差异,这表明这些miRNA参与了宿主-病原体的相互作用。Yakovlev等研究了挪威云杉发育中的种子在温暖和寒冷环境中的表观效应。在全同胞家族中,44个miRNA中的16个表达显著,这表明种子经不同温度处理具有不同表观现象。3人工小分子rna调节pal基因表达AmiRNA是一类外源的,人工设计的,能够减少互补基因转录本的丰度的小分子RNA。目前已开发的网络资源有助于amiRNA的设计,例如WMD3(/)。首先将设计好的amiRNA序列整合到功能miRNA转录本修饰的miRNA前体中。随后,这种amiRNA前体可以插入到转化载体中并介导植物的表达。与天然miRNA类似的是,amiRNA可以加工成其成熟形式并指令RISC下调目标靶基因。对于基因组已经测序的植物品种来说,可能通过选择一个amiRNA序列就有可能避免脱靶抑制从而来区分一些密切相关的基因。amiRNA技术对于树木功能基因组学具有重大意义,因为amiRNA是第1代植物转化株系主导抑制子。相比之下,隐形突变需要后续的近亲交配来产生纯合子。在杨树中amiRNA已经验证了其有效性,并且能够区别一个家族相似