box-behnken响应曲面法优化毛果鱼藤总黄酮提取工艺及其体外抑菌作用考察

box-behnken响应曲面法优化毛果鱼藤总黄酮提取工艺及其体外抑菌作用考察

毛果鱼藤是豆科植物毛果鱼藤的一种干燥的根和藤蔓，也被称为土甘草，主要分布在广东、广东等地。毛果鱼藤具有利尿除湿、镇咳化痰的功效,常用于广西壮族民间验方,如治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳嗽等症状。因其民间用药的显著疗效,引起了越来越多研究人员的关注。黄酮类化合物是毛果鱼藤中主要的活性成分,有研究表明黄酮类化合物具有抗炎、抗HIV、抗癌、抗氧化、降血脂、降血压、降血糖等作用。近年来,国内有关毛果鱼藤的研究主要有资源调查,药材性状、薄层、紫外光谱的鉴别以及抗炎镇痛、止咳祛痰等药理、毒理学方面的研究,但对其提取工艺、生物活性等方面的研究甚少,对其总黄酮提取工艺及抑菌作用的研究尚未见报道。采用BoxBehnken响应曲面法,可将各因素与响应值之间的函数关系用多项式进行拟合,通过对回归方程以及响应面的分析寻求最佳工艺条件;采用纸片扩散法考察总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠球菌和溶血性链球菌的抑菌作用。本研究以毛果鱼藤为原料,采用Box-Behnken响应面分析法对毛果鱼藤总黄酮的提取工艺进行优化,可为高效率地提取毛果鱼藤总黄酮成分及进一步开发其药理作用提供可靠的实验依据,同时也为进一步开发和合理利用毛果鱼藤这一药用植物资源提供了参考数据。1设备和材料1.1催化合成/萃取仪UVmini-1240分光光度计(Shimadzu公司);XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司);SB-3200DTDN超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司);ZHJH-1109B超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司);HHB11电热恒温培养箱(天津市实验仪器厂)。1.2藤茎及毛果鱼藤茎营养琼脂(天津市英博生化世纪有限公司)。阳性对照药:盐酸左氧氟沙星(山东鲁抗医药,130701)、阿莫西林胶囊(先声药业,02-130701)、氨苄青霉素钠(Sigma公司)、制霉菌素(Kayon公司)。毛果鱼藤藤茎购自广西靖西,经广西中医药大学田辉教授鉴定为毛果鱼藤DerriseriocarpaHow藤茎。芦丁对照品购于中国食品药品检定研究院(批号100080-200707)。1.3病毒金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠球菌、溶血性链球菌由广西民族大学海洋与生物技术实验室提供。2结果与分析2.1alno33样品的制备取芦丁对照品25mg,用无水乙醇溶解,定容到25mL量瓶中,摇匀,配制成质量浓度为1mg/mL的芦丁标准溶液,保存,备用。取上述芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL量瓶中,分别加入5%NaNO2溶液1mL,摇匀,静置6min后加入10%Al(NO3)3溶液1mL,摇匀,静置6min后加入4%NaOH溶液5mL,定容至25mL。摇匀,静置5~10min后,于510nm波长处测定吸光度,每份样品均检测3次。以标准溶液的质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程:y=2.3065x-0.0512,r=0.9997。2.2黄酮提取过程的优化2.2.1单因素试验2.2.1.样品前处理称取毛果鱼藤5份,每份2.0g,70℃,400W功率,用20倍体积的95%乙醇分别提取10、15、20、25、30min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm测定,所有样品均检测3次。结果(见图1)表明,随着提取时间的延长,总黄酮提取量逐渐增加,但当提取时间达25、30min时提取率改变不大,从节约能源等因素考虑,选择25min为最佳提取时间。2.2.1.样品的提取称取毛果鱼藤5份,每份2.0g,70℃,用20倍体积的95%乙醇分别在功率为300、400、500、600、700W提取25min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm测定,所有样品均检测3次。结果如图2所示,随着提取功率的增大,在500W处出现小高峰,此后随着功率继续增加,提取量呈下降趋势,故功率选择500W为宜。2.2.1.3.乙醇体积比对总黄酮提取率的影响2.2.1.样品中乙醇提取称取毛果鱼藤5份,每份2.0g,70℃,功率为500W,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,用85%的乙醇提取25min,提取2次,定容到100mL量瓶中,在510nm测定,所有样品均检测3次。结果如图4所示,随着料液比增加,黄酮提取率也随之增加,当料液比达到1∶40出现最高点,继续增大料液比提取率变化不大,从减少试剂用量和保证提取效率的综合因素考虑,选择最优的料液比为1∶40。2.2.1.提取次数的测定称取毛果鱼藤份5份,每份2.0g,70℃,功率500W,料液比分别为1∶40,用85%乙醇提取25min,分别提取1次、2次、3次,定容到100mL量瓶中,在510nm处测定,所有样品均检测3次。结果如图5所示,随着提取次数的增加,提取率逐渐增加,提取次数由2次到3次时,总黄酮提取率增加的幅度不大,说明总黄酮已提取完全,故提取次数选2次为宜。2.2.2毛果鱼藤总黄酮提取工艺优化综合单因素试验结果,选取影响毛果鱼藤总黄酮提取率的提取时间(A)、料液比(B)和乙醇体积分数(C)这三个主要因素作为考察因素,以总黄酮提取率为试验指标,采用Design-Expert8.0.6b软件结合Box-Behnken设计法优化毛果鱼藤总黄酮提取工艺。每因素设3水平,用代码-1、0、+1表示,试验因素水平及编码见表1。2.2.2.毛果鱼藤黄酮提取模型拟合应用Design-Expert8.0.6b软件中Box-Behnken设计分析方案,试验结果如表2所示,试验组1~12是析因试验;试验组13~17是中心试验,试验重复5次。采用Design-Expert软件对表2所得的数据进行统计分析,分析结果如表3所示。对各因素进行回归拟合,得到回归方程如下:式中:A为提取时间、B为料液比、C为乙醇体积分数。各项系数的绝对值代表相应因素对黄酮提取量的影响程度,系数的正负代表影响方向。由表3数据可以看出,A、B、A2、B2对黄酮提取率影响极显著,AC、C2对黄酮提取影响显著。A、B、C三个因素中,对于毛果鱼藤黄酮提取率的影响程度由大到小为B>A>C。拟合模型的修正相关系数平方(R2)为0.9790,即97.90%的数据可用此方程解释;失拟项检验值>0.05,不显著;用上述方程描述各因素与响应值的关系时,其变量和全体自变量之间的线性关系(R=7.77/7.94=0.9786),模型的显著水平P<0.0001,回归方差模型极显著,表明该方程可靠且对实验拟合良好,无其他因素的显著影响,实验误差较小,可对不同条件下的总黄酮提取率进行分析和预测。2.2.2.料液比和提取时间的交互作用响应曲面图中的响应值与各影响因素所构成的三维空间的曲面图以及其在二维平面上的等高线图,可较为直观地反映出各因素及各因素的相互作用对黄酮提取率的影响。应用Design-Expert软件中的Box-Behnken模型,将影响毛果鱼藤总黄酮提取率的一个因素固定为零水平,得到另外两个因素对提取率的交互影响结果,其对应的响应曲面及等高线,结果如图6~8所示。图6结果显示,在料液比不变的条件下,随着提取时间的增加,提取率先增加后降低,但是变化幅度不大。当料液比在低水平时,提取率的变化不大,而且提取率比较低;在高水平条件下,提取率变化较大。在提取时间不变的情况下,随着料液比的逐渐增加,提取率呈现上升趋势,且变化明显。由响应曲面图可以看出料液比与提取时间的交互作用比较显著。图7显示,在提取时间不变的条件下,随着乙醇体积分数的增加,提取率稍有增加,但是变化幅度不大,且均处于较高水平。在乙醇体积分数不变的情况下,随着提取时间的增加,提取率呈现上升趋势,且在25min左右出现峰值,随后又降低。由响应曲面图可以看出料液比与提取时间的交互作用比较显著。图8显示,在料液比不变的前提下,随着乙醇的体积分数的增加,黄酮的提取率增加不明显。在乙醇的体积分数不变的前提下,随着料液比的增加,黄酮的提取率呈递增趋势,且在料液比为1∶40~1∶45的范围内,出现定点,表示在此范围内提取率出现最大值。2.2.3总黄酮理论提取率测定结果在选取的各因素范围内,根据回归模型通过Design-Expert软件分析结果,得出毛果鱼藤总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取时间为24.46min,料液比为1∶44.34,乙醇体积分数为88.18%,在此条件下总黄酮理论提取率为4.322mg/g。为了便于实际操作,选择提取时间为25min,料液比1∶45,乙醇体积分数为90%,提取功率为500W条件下进行实验验证,提取率分别为4.297、4.334、4.323mg/g,平均提取率为4.318mg/g,表明毛果鱼藤黄酮的提取率与预测值基本吻合,说明预测模型与实际情况拟合较好。2.3黄酮菌试验的研究2.3.1总黄酮的提取称取毛果鱼藤20g,按照上述实验得到的优化工艺条件进行毛果鱼藤总黄酮的提取,过滤提取液,浓缩,得到总黄酮粗粉3.75g(相当于总黄酮85.48mg),取粗粉0.88g,用1mLDMSO溶解,制成总黄酮质量浓度为20.0mg/mL的溶液,备用。2.3.2抑菌圈的直径测定用打孔器将定性滤纸打成直径6mm的纸片,将纸片高压灭菌,烘干,在无菌的条件下,用镊子将灭菌后的纸片放入“2.3.1”项中制备好的黄酮溶液中浸泡;用涂布法将各供试菌液涂布接种在培养基上,再用镊子将浸泡在黄酮溶液中纸片放入到培养基上,药敏片做为阳性对照,DMSO浸润的滤纸片作为阴性对照(-),然后将培养皿置于37℃的培养箱中培养24h,测量抑菌圈的直径(Ф)。判断标准:Φ>6mm,判为有抑菌作用;Ф≤6mm,判为无抑菌作用;-为无效,10mm>Ф>6mm为低度敏感(+);15mm>Ф>10mm中度敏感(++);Ф>15mm为高度敏感(+++);结果如表4所示,毛果鱼藤总黄酮提取物质量浓度为20.0mg/mL时,对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用,属于高度敏感,但对大肠杆菌、变形杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、血溶性链球菌却没有抑菌作用。3box-behnken效应面法本研究以毛果鱼藤总黄酮提取率为指标,通过单因素试验就料液比、提取时间、乙醇体积分数、提取功率和提取次数对毛果鱼藤总黄酮提取率的影响进行考察;在此基础上,利用Design-Expert软件结合Box-Behnken设计法设计响应曲面试验,建立了数学模型,预测得到了最优的提取工艺参数,分别为:提取时间为24.46min,料液比为1∶44.34,乙醇体积分数为88.18%,在此条件下总黄酮理论提取率为4.322mg/g,并对实验进行验证,验证试验毛果鱼藤总黄酮平均提取率为4.318mg/g,与理论值(4.322mg/g)接近,表明Box-Behnken效应面法应用于中药提取工艺筛选具有可行性。此外通过对毛果鱼藤总黄酮提取物进行体外抑菌作用研究,表明质量浓度为20.0mg/mL毛果鱼藤总黄酮对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用,但对变形杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、白色念