茎尖微嫁接技术在无病木培养中的应用

茎尖微嫁接技术在无病木培养中的应用

佛手柑科。var.sacodiciii已经是广州科的一种柑橘植物。这种干燥的水果通常是具有益肝、理气、胃痛的常用中药。佛手在我国栽培历史悠久,为广东道地药材“十大广药”之一。佛手在生产中面临黄龙病的危害,黄龙病是由类细菌Liberobacterasiaticum引起的毁灭性和传染性病害,主要通过木虱转移吸食和带病苗木、接穗等繁殖材料传播。发病初期,新抽出的枝梢,其叶片不能正常转绿,表现斑驳或均匀黄化症状,直至全株枯黄死亡,且迅速蔓延,目前对病害本身还无有效的防治手段。而且,佛手生产上采用扦插和嫁接繁殖,长期的无性繁殖,病原体逐代传递和积累,造成植株长势减弱、生活力下降、产量降低、品质下降,严重威胁佛手的生产和药材质量。佛手产区的扩大,使得接穗和苗木在不同地区间传送,又加剧了病害的扩散和蔓延。因此,运用现代生物技术培育脱病原体苗,已成为佛手生产中极为迫切的问题。茎尖微嫁接技术可以脱除病原体,已在柑桔、沙田柚上获得成功,并逐步在生产上应用。本文采用茎尖微嫁接技术脱除佛手病原体,并应用聚合酶链式反应(PCR)对其进行黄龙病病原检测,以建立行之有效的病原检测方法,从而为佛手品种复壮和种质资源的可持续利用奠定基础。1材料、机器和试剂1.1黄自生苗,生苗感染黄龙病的佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle,来源于广东省肇庆地区,通过电镜和PCR检测证明感染了黄龙病病原;砧木为柠檬Citruslimon(Linn.)Burm.f.C.medica.var.limonLinn.实生苗;感染黄龙病的甜橙(采自广州市罗岗镇);健康一年生柠檬实生苗(采自广州中医药大学药圃)。以上材料的原植物均由广州中医药大学中药鉴定学教研室张丹雁教授鉴定。1.2pcr检测方法PCR仪(AppliedBiosystems2720Thermalcycler);UVPGDS7600型凝胶成像仪;TECANSpectraFLUORplus多功能酶标仪;SK2492型PCR扩增试剂盒及引物(加拿大Sangon独资上海分公司);3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒;DNAMarker(200bpDNALadderplus)。2方法2.1茎尖微移植2.1.1养基、养基、培养条件取成熟柠檬果实中的种子,经表面消毒,剥去种皮,接种于MS培养基上,在培养箱中黑暗条件下培养,培养温度为28℃;采摘2～3cm长的佛手病株嫩芽,切取0.5～1cm茎尖,经常规消毒后,在双目显微镜下剥取约0.2mm的茎尖作为接穗。2.1.2插装法提取“t”字在无菌条件下,将砧木苗从培养瓶中移出,切去部分过长的根并去顶,在双目显微镜下,用自制的解剖刀在上胚轴上切成倒“T”字形切口,将茎尖接到砧木的倒“T”字形切口上,外缠parafilm膜。2.1.3附加6-ba将嫁接苗移入带滤纸桥的液体培养基中,以MS为基本培养基,附加6-BA0.1mg·L-1和7.5%的蔗糖;培养温度为25±1℃,每d光照12h,光照强度为2kLx。观察嫁接苗的长势,45d后记录嫁接成活率。2.1.4采用SPSS11.5统计软件对计量资料进行方差分析,比较采用LSD法。2.2龙庆病抗病性2.2.1pcr检测dna分离效果采用3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒分别提取各样品总DNA。将提取到的DNA用纯水稀释10倍后,用酶标仪分别测定其在260nm、280nm处的吸收值,计算出OD260与OD280的比值及DNA浓度,并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果的优劣。2.2.2pcr检测结果采用3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒提取样品总DNA,紫外分光度法检测DNA纯度和浓度,并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果。根据法国Villechanoux教授发表的黄龙病部分DNA序列(基因序号码为M94319)设计引物。引物P1(TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGAG)与黄龙病DNA序列的37～60位核苷酸同源;引物P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)与462～485位核苷酸互补,PCR产物的分子量为570bp。2.2.3pcr检测taq酶2.55反应体系为1O×buffer缓冲液5μL,dNTPs5μL(2mmol/L),MgCl23μL(25mmol/L),Taq酶0.5μL(5u/μL),引物各0.5μL(30μmol/L),DNA模板100ng,加入灭菌纯水至50μL。循环参数为94℃5min,随后94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,35个循环,最后72℃延伸10min。反应完毕后,取扩增产物10μL经1.5%琼脂糖电泳后在凝胶分子成像仪上检测并拍照记录。3结果与分析3.1茎尖微嫁接苗的萌发在无菌条件下,将砧木苗从培养瓶中移出,切去部分过长的根,并去顶,在双目显微镜下,将切好的茎尖嫁接到砧木上胚轴的倒“T”字形切口上,外缠parafilm膜,再将整株移入带滤纸桥的液体培养基中。培养一周后,接穗和上胚轴切口处产生愈伤组织,嫁接苗开始成活。这时要及时除去砧木上长出的不定芽以减少对接穗萌发的影响;两周后,接穗开始萌生新叶,砧木也长出少量白色、幼嫩的新根;45d后,茎尖微嫁接苗长出6～8片真叶,见图1A。此时,将其从培养室中移出,在室内自然光下培养3d,取出用蒸馏水洗净,单株移入混合土壤(50%的营养土:50%细砂)的营养钵中,注意植株的保湿。一个月后,茎尖微嫁接成活苗可以长出10片左右新叶,见图1B。3.2生物量检测在98株微嫁接成活苗中随机选取10株进行黄龙病病原PCR检测,以感染黄龙病的甜橙叶片作为正对照,健康一年生柠檬实生苗作为负对照,同时检测表现黄龙病症状的佛手叶片。结果表明:感染了黄龙病病原的甜橙及表现黄龙病症状的佛手,在预计的570bp扩增出特异的电泳谱带,而健康柠檬实生苗及佛手茎尖微嫁接苗均未扩增出特征谱带,表明佛手的感病症状是由黄龙病病原引起的,茎尖微嫁接技术可以脱除佛手黄龙病病原。见图2。3.3苗木、接穗愈伤组织的影响在上述试验中发现,切取约0.2mm(带2个叶原基)的茎尖进行嫁接,所获得的嫁接苗全部脱除病原体,但嫁接成活率低,难以满足生产需要。通常认为,茎尖越大,嫁接成活率越高,但带病原体的几率也越大。本实验对不同大小的茎尖:无叶原基、带2个叶原基、带4个叶原基及带6个叶原基,分别进行微嫁接试验。观察嫁接后伤口的变化,7d后产生少量的愈伤组织,10d后愈伤组织可达到最多,砧木愈伤组织前期并不比茎尖生长快,但10d后,由于根系能不断供给水分和营养,砧木愈伤组织能够将空隙很快填满,当砧木愈伤组织和接穗愈伤组织连接后,细胞之间通过胞间连丝使水分和营养物质沟通。此后,双方进一步分化出新的形成层,并能形成新的木质部和韧皮部,使接穗和砧木之间运输水分与营养物质的输导组织贯通,这样,便形成了一个新的整体。双方愈伤组织形成越多,嫁接成活率就越高。因此,嫁接成活的关键是砧木和接穗能否长出足够的愈伤组织。由表1可以看出,茎尖大小直接影响嫁接成活率,带2、4、6个叶原基能明显提高嫁接成活率(P<0.01),带4个叶原基的茎尖嫁接成活率最高,达60.00%,与带6个叶原基的茎尖嫁接成活率存在明显差异(P<0.05);6个叶原基的茎尖嫁接成活率有所降低,这可能是因为砧木接口较细,茎尖大时,造成砧木裂口较大,砧木和茎尖的愈伤组织不能很快将空隙填满,所以两者不易愈合;无叶原基的茎尖嫁接后,一般在1～3d内就变褐、死亡,可能是因为仅有生长锥,活力有所下降,形成的愈伤组织少,同时剥取操作时间较长,分生组织细胞有一定损伤。砧木上产生的不定芽数和不定芽的长度也和嫁接成活率密切相关,嫁接成活率越高,产生的不定芽数和不定芽长度就越小,这可能是因为接穗成活后会通过砧木吸收营养,从而抑制了砧木上不定芽的生长。3.4茎尖大小对脱db的影响进行茎尖微嫁接时,切取茎尖越小,带有病原体的可能性就越小。在上述试验中,以带2个叶原基、4个叶原基及6个叶原基的茎尖为接穗,分别获得了嫁接成活苗。现采用PCR技术分别对其进行黄龙病病原的检测,考察茎尖大小对脱除病原体效果的影响,结果见图3。以带2个叶原基的茎尖嫁接获得的成活苗,脱病原体率为100%;带4个叶原基的茎尖微嫁接苗,脱病原体率可达85.71%。随着茎尖增大,脱病原体率明显下降。根据Navarro等在柑桔上的研究证明,只有小于0.2mm(约2个叶原基)的茎尖是完全不带病原体的。本研究也表明,带2个叶原基的茎尖脱病原体率为100%,但嫁接成活率较低,仅为21.67%。因此,综合考虑嫁接成活率及脱病原体的效果,宜选用带3～4个叶原基的茎尖来进行脱病原体苗的生产。4茎尖的微嫁接佛手病害较为严重,黄龙病是由类细菌(类菌原体)侵染所致,以木虱作为传播媒介,是一种毁灭性的病害,目前尚无有效的防治措施。因此,无病苗木的培育对生产高产、优质的佛手药材具有重要意义。茎尖微嫁接技术可以脱除植物的各种病原体,而且既不会产生变异,也无童期现象,因此已成为获得柑桔属植物无病原体苗木的最佳途径。由于引起病害的微生物在植物体内的活动主要是通过植物的输导组织,而茎尖的分生组织并未形成输导组织,加上顶端分生组织细胞分裂速度快,所以通过茎尖微嫁接可以获得脱病原体苗。茎尖大小对嫁接成活率和脱病原体率的影响较大,取材过小,虽然脱病原体效果好,但是剥离和培养成活很困难取材过大往往影响脱病原体效果。本研究表明,带2个叶原基的茎尖,完全不带病原体,但嫁接成活率低。综合考虑嫁接成活率及脱病原体的效果,可以选用带3～4个叶原基的茎尖来进行脱病原体苗的生产。黄龙病病原细菌分为两个株系:亚洲株系和非洲株系,目前在我国发现的均为黄龙病原亚洲株系,法国Villechanoux教授发表了黄龙病(L