香蕉幼苗防御酶活的研究

香蕉幼苗防御酶活的研究

香蕉萎缩，也称为香蕉巴氏病和黄叶病，是一种由肝脏破坏引起的毁灭性疾病。其病原菌是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,FOC),又称香蕉枯萎病菌。木霉菌,作为重要的植物病害生防菌,已经引起广泛关注,在国内外的研究中,利用绿色木霉防治植物病害,物别是土传病害的报道很多,但是对于绿色木霉对植物抗病代谢的研究很少。诱导抗病性是指利用物理的、化学的以及生物的方法,预先处理植物,从而改变病害反应,使原来感病反应产生系统或局部的抗性。植物组织内的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)等酶的活性大小,反映了植株抗病性的强弱。本研究通过测定施用绿色木霉H6以及病原菌菌液后,香蕉苗根部酶活性的变化趋势,为进一步开发木霉生物杀菌剂奠定基础。1材料和方法1.1霉菌h菌株供试香蕉枯萎病病原菌(Foc4)以及生防木霉菌(H6)菌株为海南大学农学院分离筛选保存菌株。供试香蕉苗为6叶的巴西蕉幼苗,大小基本一致,由中国热带农业科学院组培中心提供。1.2测试方法1.2.1tt-lplau/ml将供试木霉菌H6、香蕉枯萎病病原菌,接种到PDA液体培养基中,于180r/min、28℃摇床中,培养4~5d,用无菌水稀释到孢子浓度约为106CFU/mL,备用。分别于接种后的第1、3、5、7、9d,用消毒剪刀剪取新长出的香蕉叶片,液氮冷冻后于-80℃冰箱保存,用于酶粗液制备。1.2.3酶粗提液的制备将1g样品,放入预冷的研钵中,加入1.5mL在4℃预冷的硼酸缓冲液及0.2g石英砂,冰浴中研磨成匀浆,4℃下静置30min,再用10000r/min、4℃,离心30min,上清液即为酶粗提液。-20℃低温保存。1.2.4丙氨酸为底物(1)过氧化物酶(POD)活性测定。以愈创木酚为底物,用陈捷等的方法测定。(2)PAL活性测定。以L-苯丙氨酸为底物,按许勇的方法有所改进。(3)CAT活性测定。以过氧化氢为底物,按陈捷等的方法测定。(4)SOD活性测定。以核黄素为底物,按王爱国等的方法测定。(5)PPO活性测定。以邻苯二酚为底物,按陈捷等的方法测定。(6)酶粗提液及未知样蛋白含量的测定。参照Broadford的方法,用考马斯亮兰G-250法进行。2接种木霉菌对第5d酶活的影响由图1可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌处理(H+F),酶活开始时变化不显著,总体始终高于其他处理,其酶活在第5d达到最高峰,峰值为376.30U/(g·min),其后缓慢下降,在第9d时其酶活仍为对照组的3倍。接种病原菌处理(F),酶活力在第1~3d之间与对照处理(CK)酶活性无显著差别,在第5d酶活性达到最高峰,峰值为209.67U/(g·min),其后又慢慢回落。接种木霉菌处理(H),酶活略低于处理(H+F),其酶活在第5d达到最大值,峰值为352.54U/(g·min)。对照组酶活变化不明显,其变化范围为74.67~105.05U/(g·min)。由图2可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌处理(H+F),酶活在第1d和第3d变化不显著,稍大于只接病原菌处理(F),酶活在第5d达到最高峰,峰值为11.09U/(g·min),而后又急速下降,在第7d和第9d,酶活与只接病原菌处理(F)相差不大。接种病原菌处理(F),其酶活略高于对照,酶活在第5d时达到最大值,其峰值为5.53U/(g·min),酶活变化不显著,其变化范围为3.18~5.53U/(g·min)。接种木霉菌处理(H),在第3d酶活明显高于其他各处理,其后在第5d酶活达到最大值,其峰值为10.46U/(g·min)。对照酶活变化不显著,变化范围为3.00~3.24U/(g·min)。2.3接种木霉菌对小鼠血清酶活的影响由图3可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌处理(H+F),从第3d酶活始终高于其他处理,在第5d达到酶活最高峰,峰值为96.65U/(g·min),而后缓慢下降,在第9d时,酶活仍为对照组的3倍。接种病原菌处理(F),酶活在第1d时明显高于其他处理,分别在第1d和第5d达到最大值,其峰值分别为44.38、50.33U/(g·min)。接种木霉菌处理(H),酶活在第5d达到最大值,峰值为85.57U/(g·min),比处理(H+F)略低。对照组(CK),酶活变化并不明显,变化范围为26.84~28.31U/(g·min)。由图4可知,接种木霉菌处理(H),第1d酶活低于其他处理,其后酶活明显急速上升,在第5d达到最高峰,其峰值为210.27U/(g·min),而后急速下降,在第9d时,酶活降到与对照组值相当。接种病原菌处理(F),第1d酶活高于其他两个处理,为130.14U/(g·min),随后酶活变化不明显,变化范围为130.14~156.88U/(g·min)。接种木霉菌处理(H),第3d开始酶活始终高于其他处理,在第5d达到最高峰,峰值为250.48U/(g·min),而后酶活急速下降,第9d酶活下降到与对照组酶活值相当。对照组酶活变化不明显,变化范围为130.36~145.25U/(g·min)。由图5可知,第1d时对照组酶活明显高于各个处理组,酶活为100.32U/(g·min),为其他处理的2.7倍。接种木霉菌1d后接种病原菌处理(H+F),从第3d开始明显高于其他处理组,在第5d达到最高峰,峰值为158.65U/(g·min),其后急速下降,在第7d降到最低,在第9d又有所回升。接种病原菌处理(F),酶活在第5d达到最高峰,峰值为187.33U/(g·min)。接种木霉菌处理(H),酶活在第5d达到最大值,峰值为221.32U/(g·min),变化趋势同其他处理组大致相同。对照组酶活呈现先下降后上升的趋势,变化范围为35.67~100.32U/(g·min)。3接种木霉菌对香蕉幼苗叶片酶活性的影响POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与植物代谢及抗逆性都有密切关系。植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体,过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。本研究中,接种木霉菌1d后接种病原菌处理后香蕉苗中POD酶活性明显增强,呈现由增到减的趋势,且呈现急速上升,在第5d达到最高峰,而后缓慢下降。PAL是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶,与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关,对植物色素形成、植物细胞分化和木质化过程、参与植物抗病作用与抗虫害作用、参与植物抗逆境作用中有重要意义。本研究中,接种木霉菌1d后接种病原菌处理后的香蕉苗叶片中PAL显著增加,呈现明显的由增到减的变化趋势,且其酶活高于其他处理。与POD酶活不同的是,其酶活呈现急速上升,在第5d达到最大值,而后酶活又迅速下降。CAT是植物体内清除过氧化氢的主要酶类,植物代谢过程会产生活性氧自由基,再转化成过氧化氢,而过氧化氢对植物细胞具有损伤作用。过氧化氢酶的主要功能即清除植物代谢过程产生的过氧化氢,从而对植物细胞具有保护作用,植物过氧化氢酶还与环境污染与胁迫、营养元素缺乏、病虫害危害有关。本研究中,接种木霉菌1d后接种病原菌处理后的香蕉叶片中CAT酶活性开始时低于病原菌处理的,第3d后酶活性急速上升,第5d达到最高峰,其后下降趋势缓慢。SOD是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质,植物病原菌能够诱导植株产生活性氧自由基,活性氧自由基过多累积会导致植株过敏性死亡。因此SOD是一种与植物的防御反应密切相关的酶。本研究中,接种木霉菌1d后接种病原菌处理后的香蕉叶片中SOD酶活性显著增加,并且呈现先上升后下降的趋势,在第5d达到最大值,在第1d和第9d时酶活与对照组相差不大。PPO是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶,它可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应的醌类物质。醌类物质对病原微生物起着抑制作用或杀伤作用,具有一定的抗病能力。因此,在感病的植物体中,PPO活性都有不同程度的提高,以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织。本研究中,接种木霉菌1d后接种病原菌处理后PPO在第1d活性较低,而后出现上升趋势,在第5d达到最大值,而后又出现急速下降,在第7d达到最低,然后又出现上升趋势。试验结果表明SOD、PAL、CAT、POD、PPO酶活性均明显提高。证明先接种木霉菌后接种病原菌可以提升香蕉植株的抗病性,增强了植物