甘薯茎尖培养脱毒技术研究

甘薯茎尖培养脱毒技术研究

甘薯病毒是世界上常见的疾病，发生在中国的主要甘薯产区。罹病甘薯的产量和品质均有不同程度下降,造成所谓“种性退化”。经在山东省调查,某些品种的苗床病株率已达90%以上,田间病株率也在60%～70%。国外早在本世纪50年代末就开始进行甘薯病毒调查鉴定工作,目前报道的甘薯病毒及其类似病害有10余种。Nielsen(1960)首次报道用分生组织培养消除甘薯病毒。我国于50年代曾报道过甘薯病毒病的发生,但未能深入研究,直到90年代才鉴定出我国甘薯主栽区病毒种类为甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯潜隐病毒(SPLV),并在山东省发现自然侵染甘薯的烟草花叶病毒(TMV)。目前对感染病毒的甘薯尚无有效治疗方法。1991～1996年作者对甘薯茎尖培养方法、脱毒效果、组培苗病毒检测技术等进行了研究,结果报道如下。1材料和方法1.1紫环斑、羽状驳岸苗的收获以山东省12个主栽甘薯品种为试材,将田间表现紫环斑、羽状斑驳、紫斑等症状病苗的薯块收获,藏窖2个月后,置28～31℃下育苗2周,苗长至20cm左右时,转入20℃下备用。1.2个叶原基的茎尖取薯苗茎顶部3cm,剪去较大叶片,表面消毒后,在解剖镜下无菌剥离带1～3个叶原基的茎尖。以MS为基本培养基,附加不同浓度的NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、GA3(赤霉酸)和Ad(腺素),pH值为5.8,培养温度29±1℃,光强度1600lx,日光照16h。1.3病苗培养培养基分别含有植物病毒钝化剂1.5%TS有效成分0.15mg/L和0.015mg/L,调pH值前加入。将1.5%TS稀释1000倍,喷洒在病苗叶面,1周后进行茎尖培养。用未经药剂处理的茎尖培养作对照。1.4集体培训中毒检测1.4.1抗血清、免疫双向扩散以甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)单克隆抗体和烟草花叶病毒(TMV)抗血清,对无症苗进行斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)、琼脂免疫双向扩散及免疫电镜观察检测,每一样品重复2次。1.4.2巴西牵牛叶片发病用巴西牵牛(Ipomoeasetosa)为砧木。检测组培苗或抽检经血清学检测呈阴性反应的样品。将其顶芽部分侧接到具2～3张叶片的巴西牵牛植株上,保留巴西牵牛上部,蔽阴3～4d,15～40d内观察记载发病情况,检测SPFMV和SPLV。发病株为新生叶出现皱缩、花叶、或黄脉。苋色藜(Chenopoiumamaranticolor)用于检测TMV,待测样品加0.02mol/LpH7.2PBS研磨,用常规摩擦接种,15～20d内观察发病情况,发病株为接种叶出现米粒大小黄斑,继而发展为局部枯斑。2结果与分析2.1株苯甲胺发芽试苗的培养效果离体茎尖在含激素培养基上培养15～20d后,转入1/2MS无激素培养基继续培养生根成苗。4个品种的茎尖在11种不同激素配比的培养基上均能成苗,但成苗率和成苗时间有差异,愈伤组织发生情况也不同,其中以培养基内含6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+Ad5mg/L效果最好,愈伤组织发生中等,4品种平均发芽率为97.3%,成苗率达76.5%,接种后43～60d便可长成具5～7叶、5cm高的试管苗。不同甘薯品种在此种培养基上的成苗率为:鲁薯3号77.4%、鲁薯6号68.5%、鲁薯7号62.5%、鲁薯8号95.6%、丰收白83.3%、北京553号56.5%、徐薯18号51.2%、86-284号60%和徐25-2号50%。成苗率的差异可能与品种内源激素水平和生长特性有关。2.2茎尖培训效果2.2.1叶原基对脱毒率的影响试验用北京553号、86-284号和鲁薯7号3个品种,每处理剥离茎尖24个以上。3个品种试验结果平均值表明,切取的茎尖大小与获得无毒苗的比率呈显著的负相关(r=-0.9875*,Y=50.3-11.2X),当茎尖分生组织带1个叶原基时,脱毒率最高,为38.1%,带3个叶原基时脱毒率较低,为15.7%。切取的茎尖大小与成苗率呈极显著的正相关(r=0.9953**,Y=25.6+13.7X),当茎尖分生组织带1个叶原基时,成苗率较低,为38.6%,带2个叶原基时为54.6%,带3个叶原基时成苗率上升为66.0%。无叶原基茎尖,接种后2d全部死亡。2.2.2不同品种间脱毒率差异在苗床选择生长健壮、无明显病毒病症状的生产用苗进行茎尖离体培养,结果表明,鲁薯3号脱毒率为86.7%,徐薯18号为73.3%,鲁薯7号为84.1%,鲁薯8号为88.6%,丰收白为80%。品种间脱毒率的差异与田间植株感病程度有关,感病程度又受品种种植年限和抗病性影响。如徐薯18种植年限久、面积大、病毒病发生普遍、脱毒率较低。鲁薯7号、8号是近年来推广的新品种,脱毒率相对高些。2.3ts药剂含量对成活率茎尖生长的影响培养基中TS药剂含量为0.15mg/L时,2品种共剥离甘薯茎尖56个,在生芽培养基上培养30d时,仅有6株成活,成活茎尖虽转成绿色,稍有膨大,但无芽生成,生长停滞。培养基中TS药剂含量为0.015mg/L时,脱毒率由原来的33.3%,提高到49.5%,但对茎尖生长有抑制作用,成苗率明显降低(见表1)。病苗经1.5%TS叶面喷洒,1周后再行茎尖剥离培养,脱毒效果无明显提高。2.4组宝苗抗病性分析及结果2.4.1人民抗体检测结果比较用SPFMV单克隆抗体采用Dot-ELISA检测6个品种107株无症组培苗,以保存在巴西牵牛上的SPFMV病样和甘薯病苗作阳性对照,脱毒甘薯苗作阴性对照,呈阳性反应的17株,阳性率15.9%。用琼脂免疫双向扩散法检测5个品种90株试管苗,只有1株产生肉眼可见的沉淀线,为阳性反应,阳性率1.1%。两种方法检测结果比较,Dot-ELISA灵敏度明显高于琼脂免疫双向扩散法,原因是琼脂免疫双向扩散法,需要较高的病毒浓度,才能检出该病毒的存在,同时也表明,有的试管苗虽未完全脱毒,但植株体内的病毒含量降低了。用TMV抗血清采用Dot-ELISA检测264株试管苗,以保存在济薯12号上的TMV病样作阳性对照,2株有明显阳性反应。2.4.2病株率及病株率88株组培苗嫁接巴西牵牛,有16株发病,病株率为18.2%。60株组培苗摩接苋色藜,用保存在济薯12号上的TMV病样作对照,除对照外,均未出现枯斑反应。2.4.3无症标样粒体免疫电镜和普通电镜观察4个品种37个无症标样,有4个样品有弯曲线状粒体,长度约为800～850nm。免疫电镜下,病毒粒体边缘增厚有明显修饰作用。3组培材料的脱毒能力甘薯茎尖组织培养,一般品种都能获得试管苗,但成苗率较低,成苗所需时间较长。本研究筛选的培养基激素配比,并结合在生芽培养基上适宜培养天数,使离体茎尖培养成苗率提高5.8%～21.0%,成苗期缩短20d左右。切取的茎尖大小与脱毒率呈显著的负相关,切取的茎尖越小,获得无毒试管苗的比率就越高。但茎尖分生组织不带叶原基,离体茎尖不能成活。本试验切取带1个叶原基茎尖的脱毒效果与廖嘉信切取0.2～0.4mm茎尖进行培养脱毒的效果相近。因此以分生组织带1～2个叶原基或切取茎尖的长度小于0.4mm效果较好。田间施用TS制剂防治作物病毒病,具有明显的抑制钝化病毒的作用。在培养基中添加适量的TS制剂可以提高脱毒率,表明此化学制剂对甘薯病毒也有良好抑制、钝化作用,但对茎尖的生长发育有影响,成苗率有所降低。选用无症状、生长健壮的薯苗做组培材料,可提高组培苗的脱毒率,从而提高工作效率,降低生产成本。只要获得了无毒苗,利用单茎节快繁技术,1株苗每月可扩大繁殖6～7株,短时间内就能获得大量的无毒苗。由于带毒植株并不都表现症状,因此对茎尖组培苗要进行严格的病毒检测。SPFMV发生最普遍,为害最重,是国内外研究报道最多的一种甘薯病毒,并已有成功的检测技术,本研究的脱毒效果主要针对此种病毒。国内外对SPLV的研究较少,其分类地位尚未确定,用巴西牵牛采用嫁接法,能检测出