基因工程重点

基因工程基因：是遗传的物质基础，是DNA分子上含有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是含有遗传效应的DNA分子片段。基因图谱：基因组：指单倍染色体细胞中涉及编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。载体：能载带微量物质共同参加某种化学或物理过程的常量物质，是基因工程重组DNA技术中将DNA片段转移至受体细胞中的一种能自我复制的DNA分子，三种常见的载体为细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。克隆载体：事实上是一种含有特定功效的DNA分子，它们能携带外源DNA片段或基因进入细胞，并使其在受体细胞中得以维持体现。体现载体：体现载体是用来在受体细胞中体现（转录和翻译）外源基因的载体。穿梭载体：YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的其中酵母DNA片段不仅提供了选择标记还携带来自酵母染色体DNA的自主复制次序(ARS).由于它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，因此能在两种细胞中存在和复制.能够在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体。（这类载体能够在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和体现。）RACE技术：RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的办法。密码子：mRNA上有一段编码区，在这一区段内，每3个核苷酸构成一种密码子，密码多肽链上的一种氨基酸。CDNA文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，协助从起始AUG处开始翻译。MCS：多克隆位点，是包含在多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，是基因工程中惯用到的载体质粒的原则配备序列。EST：体现序列标签，是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列。（普通它含有足够的构造信息以显示出该基因与其它基因的差别，长度为100~500bp。）探针：是指含有同特异性目的分子产生很强的互相作用并可对其互相作用的产物进行有效检测的分子。蓝白斑筛选：是一种基因工程惯用的细菌重组子的筛选办法，重组菌斑呈无色透明，非重组菌斑则呈蓝色。转座子：它是一种特殊的DNA序列，能够在染色体上从一种位置跳跃到另一种位置，或者在染色体之间跳跃。增强子：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，可处在上游，也可处在下游。启动子：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它普通位于基因的上游。操纵子：是一组核心的核苷酸序列，涉及了一种操纵基因（Operator），一种普通的启动子，及一种或以上的构造基因被用作生产信使RNA（mRNA）的基元。基因诊疗：就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊疗，它涉及产前诊疗，是一种新的临床诊疗办法。基因治疗：是指以正常的基因替代或修补患者细胞中的缺点基因从而达成治疗疾病的目的，是治疗分子疾病最有效的手段之一。基因敲除：基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，含有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础，上发展起来的。转染：是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的办法，将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。转化：外源遗传物质(如质粒DNA等)进入细菌，引发细菌遗传变化的现象。粘性末端：两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，酶切成果使DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，可同另一DNA片段互补核苷酸末端黏结，这样的DNA片段称为黏性末端。平末端：两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称构造中心，酶切割产生的DNA片段末端是平齐的，称之为平末端。DNA芯片：又称基因芯片，它是指用原位合成或显微印刷技术，将数以万计的DNA探针分子固定于支持物的表面上，产生的二维DNA探针阵列。基因体现：是指生物基因组中构造基因所携带的遗传信息通过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功效和生物学效应的全过程。简答题和叙述题1.克隆载体DNA的基本条件。（1）针对受体细胞的可转移性（2）自主复制功效（3）明显的筛选标记（4）特定的多克隆位点（5）安全性2.限制性内切酶的活性受什么因素的影响。⑴酶的纯度。⑵DNA样品的纯度。⑶DNA的甲基化程度。⑷酶切反映的温度与时间。⑸DNA分子的构型。⑹限制性核酸内切酶的反映缓冲液。3.质粒的相溶性及机制。能在同一宿主细胞中共存的不同质粒称为亲和性质粒或相溶性。质粒复制必须同细胞质膜结合，多个质粒有各自的结合位点，而亲缘关系亲密的质粒有着相似的结合位点。当一种质粒占满结合位点后，亲缘关系亲密的其它质粒即使进入细胞也无立足之地，只能自行消失。4.染色体步移的环节。（1）首先用已知的基因或分子标记作为探针，从基因文库中筛选出与其有共同序列的克隆。（2）再以克隆DNA片段制备探针从文库中筛选出与之有部分重叠且更加靠近目的基因的一种新克隆。同理，以新克隆DNA片段作探针能够依次筛选出某些列克隆来，直至获得所需的目的基因克隆。5.提高外源基因体现的办法。（1）构建融合蛋白体现系统（2）构建分泌蛋白体现系统（3）构建包涵体体现系统（4）选择蛋白水解酶基因缺点型的受体系统6.原核细胞是抱负受体细胞的因素。（1）大部分原核生物细胞没有纤维素构成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。（3）基因组简朴，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简朴，繁殖快速，实验周期短，重复实验快。7.细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛碱性磷酸酶（CIP）的差别与应用。差别：CIP更为惯用，因其在60℃～70℃条件下保温15min就能够完全失活，便于终止反映;而BAP是耐热性酶，必须用酚-氯仿重复提取才干除去，终止反映。且CIP的活性高出BAP10～20倍。应用：（1）一是脱载体末端的磷酸基，避免在DNA重组时载体分子的自我连接。（2）另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶合用，用于DNA的末端标记。8.DNA芯片的应用。（1）基因测序（2）基因体现水平的检测（3）基因诊疗（4）新药筛选（5）临床用药9.肿瘤的细胞因子治疗有哪些种类。（1）免疫效应细胞介导的细胞因子基因治疗。（2）肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗。（3）成纤维细胞等载体细胞介导的细胞因子基因治疗。（4）以抗原呈递细胞为基础的细胞因子基因治疗。（5）肿瘤细胞靶向的细胞因子受体基因治疗。10.构建质粒克隆载体的方略。（1）能在受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝数。（2）含有外源DNA片段克隆的位点，并且克隆位点越多越好。（3）含有供选择克隆子的标记基因。（4）载体DNA分子应尽量的小。（5）构建不同用途的质粒载体时，能够根据特殊需要组装多个元件。11.增强子的特性。（1）双向性（2）重复序列（3）增强子行使功效与所处的位置无关（4）特异性（5）增强子不仅与同源基因相连时有调控功效，与异源基因相连时也有功效。12.代谢工程中提高目的产物的办法。（1）增加限速环节酶编码基因的拷贝数（2）强化以启动子为主的核心基因的体现系统（3）提高途径激活因子的合成速率（4）灭活途径克制因子的编码基因填空或者选择转基因的环节及检测办法。松弛型质粒与严紧型质粒的区别。松弛型质粒：拷贝数较多（10拷贝数以上）严紧型质粒：拷贝数少（1至数个拷贝）普通而言，小质粒多为松弛型的，大质粒多为严紧型质粒的，但无严格界限。那些酶需要引物，那些酶不要引物。需要引物的酶：引物酶、DNA聚合酶，反转录酶不需要引物的酶：RNA聚合酶三种blot检测的产物是什么。southern印迹杂交：DNA分子northern印迹杂交：RNA分子western印迹法：蛋白质多个载体的容量。质粒载体容量：不大于10kb。λ噬菌体载体容量：9～23kbDNA连接酶的活性以及使用办法。DNA连接酶，也称DNA黏合酶，此酶依赖腺苷三磷酸(ATP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水解提供的能量，催化毗邻的一条DNA链的5磷酸基(5'-P)与另一条DNA链的3-羟基(3'-OH)之间发生缩合反映生成磷酸二酯键，成果使断裂的DNA链重新接合，或使双链DNA上核苷酸之间因磷酸二酯键断裂而造成的裂口重新闭合。DNA连接酶不能催化两条游离的DNA单链的连接,也不能催化双链中DNA因缺失一种或多个核苷酸所造成的缺口(gap)连接。在细胞内，DNA连接酶参加DNA的复制、修复和重组作用;在体外，DNA连接酶参加人为控制的DNA片段连接，使基因在试管内重构成为可能基因的概念是遗传的物质基础，是DNA分子上含有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是含有遗传效应的DNA分子片段。限制性内切酶的活性。星号活性病毒载体的应用。构建cDNA基因文库用于克隆外源目的基因总结多个酶类活性的方向。CDNA文库的构建办法。环节：（1）分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA。（2）以mRNA分子为模板，合成cDNA第一链。（3）双链cDNA的合成。办法一：大肠杆菌RNaseH酶降解取代法办法二：oligo寡聚引物引导法合成双链cDNA。办法三：PCR法办法四：固相支持法（4）将合成的双链cDNA与载体重组，导入大肠杆菌宿主细胞增殖质粒的提取和电泳。细菌人工染色体的特性。BAC载体的容纳能力普通为100~350kb,容量比YAC载体小，但也含有YAC载体无可比拟的优点，以下(1)BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，缺失、嵌合及重组现象少。(2)以大肠杆菌为宿主,对宿主细胞的毒副作用小，转化率高。(3)从大肠杆菌中提取制备及其体外操作等更方便。(4)构建BAC文库比YAC文库更容易。(5)能够通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷。(6)BAC载体在克隆位点的两侧含有T7和SP6聚合酶启动子，能够用于转录获得RNA探针或直接用于插人片段的末端测序。基于上述优越性，BAC载体成为大片段基因组文库的重要载体，也是基因组测序和基因组遗传图谱和物理图谱构建的重要工具。λ噬菌体载体的特性。λ噬菌体由DNA(λDNA)和外壳蛋白构成。λ噬菌体分头部和尼部，DNA集中在头部。λ噬菌体DNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长48502bp,左右两端备有12个核苷酸构成的5凸出黏性末端,并且两者的核肯酸序列互补，即λDNA进人宿主细胞后，黏性末端连接后形成环状DNA分子。把此能连接的末端称为cos位点。黏性末端和平末端。其一，两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，酶切成果使DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，可同另一DNA片段互补核苷酸末端黏结，这样的DNA片段末端称为黏性末端。如果DNA片段未端的3'端比5'端长的称为3'黏性末端;同样，DNA片段5'端比3'端长的称为5'黏性末端。其二，两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称构造中心，酶切割产生的DNA片段末端是平齐的，称之为平末端。探针标记的办法。切口平移标记法随机引物标记法末端标记法mRNA的分布。（1）细胞中mRNA的含量即使只占RNA总量的1%~5%，但是mRNA的种类繁多，一种哺乳类动物的细胞中就有成千上万种不同的mRNA分子。（2）真核细胞的一种mRNA分子普通只携带一种肽链编码信息，合成一种多肽链，属于单顺反子的形式。（3）原核生物构造基因转录的mRNA普通是不通过加工的，其5’端不含“帽子”构造;3端不含poly(A)“尾巴”。基因治疗与基因类型。是指以正常的基因替代或修补患者细胞中的缺点基因从而达成治疗疾病的目的，是治疗分子疾病最有效的手段之一。类型：第一：正常基因，第二：反义基因，第三，自杀基因提高真核生物基因体现水平的办法。全酶与核心酶。核心酶（coreenzyme）：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5个亚基构成（α2β，βδ），没有δ基的酶叫核心酶。酶蛋白和辅因子单独存在时，均无催化活力。只有两者结合成完整的分子时，才含有活力。此完整的酶分子成为全酶。全酶=酶蛋白+辅因子RNA聚合酶的活性和种类。RNA聚合酶Ⅰ:合成核糖体RNA(rRNA)前体45S,当成熟后会成为28S、18S及5,8S核糖为RNA,是将来核糖体的重要RNA部份。RNA聚合酶Ⅱ:合成信使RNA(mRNA)的前体及大部份小核RNA(snRNA)以及微型RNA(microRNA)。由于它在转录过程中需要多个转录因子才干与启动子結合,因此这是现时最多研究的种类。RNA聚合酶Ⅲ:合成转运RNA(tRNAS)、rRNA5S及其它能够在细胞胞核及原生质找到的细小的RNA。理解基因工程产生的药品的种类。基因工程激素类药品基因工程细胞因子类药品基因工程抗体基因工程受体基因工程疫苗cos序列的概念。噬菌体λ为线性双链DNA病毒,野生型的λ噬菌体其基因组两端各有12个核苷酸的5’突出，碱基互补，为极有效的粘性末端，称为COS序列。甲基化酶的作用。甲基化酶普通与限制性内切核酸酶含有相似的识别序列，因此用限制性内切核酸酶的名称来命名甲基。（1）一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化酶甲基化，就会影响限制性内切核酸酶的酶切效率。（2）甲基化对DNA起着保护作用，为了DNA的某些区域不被限制性内切核酸酶酶切，能够使其中的某些识别序列的碱基用甲基化终止子的