荧光定量PCR实验指南

PCR试验指南第一局部一、 根本步骤：1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反响体系的配制；5、反响条件的设定；6、反响体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1〔DNA和mRNA〕的查找和比对；从“:///网点的“:///网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为翻开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，翻开后点击“save”，保存为“.seq”DNAstar软件中的Editseq“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的全部文件，点击“add”或“addall”，然后点击“Done”“assemble”进展比较。横线的参数设置的缘由，可能分为几组(contig)，假设想全部放在一组中进展比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimummathpercentage”默认设置为80，“contig”菜单下的“reassemblecontig”即可。选择凹凸的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimummathpercentage”，要对“contig”的序列的排列进展修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”的红色是不行用的。2、引物和探针设计引物设计PCR中最重要的一步。抱负的引物对只加特异性的引物所具有的令人满足的特点：²序列选取应在基因的保守区段；²扩增片段长度依据技术的不同有所分别：sybrgreenI技术对片段长度没有特别要求；Taqman50bp－150bp；²44个以上连续配对；²避开引物自身形成环状发卡构造；²1824个核苷长。引物需要足够长，保证序列独24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会而降低了产量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；²TM2℃；²3’A；²3’33个以上连续一样的碱基。²为避开基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。Taqman探针设计一般设计原则：²探针位置尽可能地靠近上游引物；²25－35bp，Tm65－70℃，通常比引物TM5－10℃，GC40%－70%。²5’G。²CG的含量。²blast中核实一次，假设觉察有非特异性互补区，建议重设计引物探针。“:///BLAST)“(/BLAST)TaqmanMGB探针设计介绍MGB探针的优点：²MGB探针较短(14-20bp)，更简洁找到全部排序序列的较短片段的保守区。²短片段探针(14-20bp)加上MGB后，Tm值将提高10℃，更简洁Tm值的要求。²MGB探针的设计原则5G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。²用primerexpress软件评价Tm值，Tm65-67℃。²尽量缩短TaqmanMGB13bp。²G4个或4G重复消灭。²原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进展SNPTaqmanMGB检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。留意：为了满4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变3’2个碱基的前方(即必需确保探针的后两个碱基是确定的保守)，以进展SNP检测。反过来，假设要进展同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。假设探针即便是13bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可到达即使是突变，仍可检测到突变。实时多重PCR探针的选择：多重实时PCRSYBRN染料，最终依据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。多重实时PCRTaqman探MGBBeacon探针。在多重PCRPCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:DNAstar软件中的Primerselect软件，翻开保守在同一文件中的多重PCR的引物计的多重探针后，在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上dimers。弹出的窗口中就告知此对引物有多少个dimerdG值进展评价(dG理论上是dG值越大越好)。3、影响PCRPCR的其他因素PCR的探针并进展设计对于实时荧光PCR尤其重要。可以说，不合理的设计意味着确定的失败。但是，好的设计并不等于好的试验结果，影响PCR和荧光PCR的因素格外多，下面择其重要进展介绍。引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度〔Tm〕。这是当50％的引物和DNATm对于设定PCR退合理的退火温度从55℃到70Tm5℃。设定TmTm——从序列一级构造和相邻oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进展：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温TmTm5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。假设两个引物Tm不同，将退火温度设定Tm5℃。或者为了提高特异性，可以在依据较高Tm5个循环，然后再依据较低Tm设计得目的模板的局部拷贝。引物浓度0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度260nm〔OD260〕测量光密度值。然后使用光吸取值〔nmol/OBeers〔1〕计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA使用计算的消光系数。这是由于引物较短，碱基组成差异很大。在oligo〔OD/μmol〕和消光系数的倒数〔μmol/OD〕。O.D.值表示量的多少，在一般状况下，20个碱基长的引物，1个O.D.100ul水后引物浓度为50pmol/ul〔50μM〕OLIGO软件，依据引物的的消浓度(μM)＝A260〔OD/ml〕×稀释系数×消光系数的倒数〔nmol/OD〕举例：计算某寡核苷酸〔1ml水中〕，10μl稀释100倍〔参加990μl〕水中。在A260处测吸光度为0.2。计算消4.8nmol/OD，代入得：引物、探针的纯度和稳定性PCR应用是足够的。局部应用DNA100％。这是个循环DNA3”到5”合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依靠于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-2010μMTE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温〔1530℃〕1周。干粉引物可以在-201年，在室温〔1530℃〕最多可以2个月。针标记效率和纯度有很大的区分。2uM〔10×〕，作为工作浓度分装多支，避光保存。热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA聚合酶的最正确延长温度在72PCRDNAPCR尤为有效。限制TaqDNAPCR反响PCR仪。这种方法简洁廉价，但并不能DNAPCR仪到达TaqDNA聚合酶在内的大局部手工Transitor®HotStartTaq酶对于自动热启动PCR来说高效可靠。Transitor®HotStartTaq是在常规Taq酶的根底上进展了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至PCR随着PCR扩增的进展，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物量。Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶在变性步骤的9520分钟才会被释放到反响中，从而完全恢复聚合酶活性。镁离子浓度PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μMdNTP的实时定量，使用3到5mM〔一般PCR是1.5mM〕PCR1mM3mM，以0.5mM递增，进展镁离子滴定。为削减Transitor®HotStartTaq酶。Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶能够在比一般的TaqDNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。模板质量模板的质量会影响产量。DNA样品中觉察有多种污染物会抑制DNASDS，在0.01％时就会抑制扩增反响。分别基因组DNA较的DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA。应留意进展PCR反响的模板质量，以增加PCR反响的成功率。模板浓度PCR扩增和荧光PCR104106个起始目的分子就足以观测到好的荧光或在溴化乙锭染色胶上观看到。所需的最正确模板量取决于基因组的大小〔下表〕。举例说，100ng1μg的人类基因组DNA3×1043×105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNAPCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10－100ng的量就足够PCR而言是格外简洁，且能分析扩增效率。1.基因组大小和分子数目的比例基因组基因组DNASize(bp)*TargetAmountofE.E.coliSaccharomycescerevisiaeArabidopsisthalianaDrosophilamelanogasterHomosapiensXenopuslaevis1.0MusmusculusZeamayspUC18plasmidDNAMolecules/µgofGenomicDNADNA(µg)for-10^5Molecules4.7×1061.8×1080.0012.0×1074.5×1070.017.0×1071.3×1070.011.6×1086.6×1050.52.8×1093.2×1051.02.9×1093.1×1051.03.3×1092.7×1051.01.5×10106.0×1042.02.69×1033.4×10111×10-63.8 3.8 防止剩余〔Carry-over〕污染PCR易受污染的影响，由于它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进展的扩增反响时，会发生共同来源的污染。这称之为残DNADNA也会是污染源〔非剩余污染〕。可以在PCR过程中使用良好的试验步骤削减剩余污染。使用带eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在预备反响前更换手套。总是使用不含有模板的阴性比照检测污染。。DNA〔UD这种酶〔也称为尿嘧啶-N-UNG〕DNA中的尿DNA区分开来。由于前面的扩增产物对UDG敏感，全部可以在PCR前对配制的反响用UDG处理以破坏剩余产物。其次局部1PCR试剂体系影响PCR的因素如此之多，您有时很难区分是什么导致您的试验结果不佳。降低试验的不稳定因素是使用优质牢靠的产品。dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系，最大程度进展以下步骤的预备：设计引物和探针、合成引物和探针、正确就能得到好的试验结果。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕同竞争对手的定量PCR体系相比供给了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以敏捷地选择您所宠爱的扩增条件，检测方法和设备。实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以准确、可重复地定量起始物质。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕是光PCR所必需的成分〔如缓冲液，dNTP，聚合酶。只需参加您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和敏捷性。hotstartTaqkit(A2023A0106)，来配制不含有UNG/dUTPPCR体系。hotstartTaq酶，UNG酶和dNTPS,来配制含有UNG/dUTPPCR体系。量PCR试剂体系！高产量和特异性的扩增FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕PCR扩TaqDNA聚合酶具有热启得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG〔DNA糖基化酶〕DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更牢靠。在产量和灵敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕的灵敏度极高〔阈循环〕。您可以更准确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反响。高度敏捷性除了灵敏度和特异性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析设置，检测方法和设备上给您供给了较高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您可以：Mix体系。PCRPCR。可以在多种设备上使用，如ABIPrism®7700,ABIGeneAmp®5700Bio-Rad的I-Cycler。TaqMan®探针和MolecularBeacon，您不必局限于特定的试剂盒。PCR体系，不管是含UNG/dUTP防污染系统还是不含该系统的。2A2023A0101试剂盒：〔探针体系〕FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul〔终浓度为1×〕；上游引物〔终浓度为50~900nM〕〔可先设200nM〕，下游引物〔终浓度为50~900nM〕〔可先设200nM〕；探针〔终浓度200nM〕；5ul〔10~100ng〕；无菌去离子水补足，使总体积到达50ul。您可以选择荧光染料SYBGREEN体系，具体请参照说明书。20-50ul间其他体积，留意保证终浓度一样。A2023A0106:反响体系终浓度(自配热启动荧光系统)：1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer〔A2023A0106〕；50－900nM的上游引物〔可先设200nM〕、50－900nM的下游引物〔可先设200nM200nM的探通常取2-5ul的模,无菌去离子水足，反响总体积通常为20－50ulUNG体系：1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+〔A2023A0105〕；0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔可先设0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP〔要调整〕(A2023A0108)；50－900nM的上游引物〔200nM〕、50－900nM的下游引物〔200nM〕、200nM的探针、通2-5ul20－50ul。3、反响体系和条件的优化:使用高产量，特异和敏捷的定量PCR试剂体系FQPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕，优化参数最少。您只需PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。使用通用PCRMasterMix合更多的反响体系，如mRNA的一般RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCRPCR，范围更宽。hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，该试剂盒中含有或不适宜产品的风险。您需要依据以下原则进展优化：1、您需要对酶量和镁离子浓度进展优化。酶的推举反响浓度为1.25－1.5〔50u1-2UMg离子推举浓度一般PCR1－3mM,荧光PCR终浓3－5.5mM，请在该范围内探讨最正确条件。2dNTP已经预混，能够充分保证产品质量和PCR的忠实性。dNTP0.2mM的浓度即可。3、另外，上游引物和下游引物浓度可先设为200nM。当结果不50nM－900nM之间进展探讨。Taqman200nM，不须探讨。选择其他种类的探针需依据要求设置探针浓度。5、可以先用推举的反响条件，假设结果不佳，可依据引物、探针设计的具体状况适合的退火温度，退火时间和循环数。6、DNA100ng以下，因不同种类的DNA定最正确的DNA2StepRT-PCR反响的其次步PCRRTDNA模板时的PCR10%。7、稀释全部探针、引物或配制模板请使用无菌双蒸水或Tris溶RNA反响应承受无RNA降解酶的水和容器进展操作。如承受hotstartTaqA2023A0101一样的热启动荧光体系〔UNG/dUTP防污染体系〕，您可以选择A2023A0105，A2023A0107和A2023A0108进展。与A2023A0106不同的是除了以上的优化步骤外，还增加了对UNG/dUTP系统进展探讨。建议先使用A2023A0106优化好产品体系后，再来优化该防污染系统。0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP(A2023A0108)。反响条件如酶量、Mg离子等都已经调好〔A2023A0106〕,您可以固定d(A,C,G)TPs0.2mM，并设定UNG浓度为0.5U(50ul)，dUTP浓度也设为0.2mM，初步来看反响结果。如dUTP浓度〔上调。直至得到满足结果。并可进展防污染力量测试〔U的扩增片断进展〕。3：影响PCRPCR的其他因素进展优化。总之，优化的指标越多，试验的不确定性就越大。避开在操作中引入更QPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕使用留意事项。4、适用的荧光仪器、试验设计、荧光曲线和数据分析；PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000(AppliedBiosystems)；MX4000(Stratagene)；iCycler(Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler(MJResearch)；Lightcycler(Roche)；ROTORGENE(CORBERT)；杭州博日〔Linegene〕。不同的仪器使用方法有所区分，但都具备对Taqman探针和sybgreen染料法的检测波长和检测力量。QPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕和通用PCRMasterMix均适合在这些仪器上进展使用。4个标准2个复孔。个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性比照荧光值的最高点作为基线。可能缘由建议解决方法定量DNA模板DMSO，SDSTaqDNA聚合酶。染了抑制剂，可以使用乙醇量或很 沉淀DNA少的扩PCR引物避开在引物3”端含有互补序列。避开可增产量设计较差 似的引物。比对，设计符合差 要求的探针PCR引物用一般电泳法，看引物的设计和合成质合成较差 量，是否有目的条带消灭。荧光探针无确保探针设计的有效性和fluorophore功能 和quencher的存在。用DNaseTaqMan否增加。必要的话设计和合成探针。10^42530低 个循环中获得信号。镁离子浓度从3mM到5mM间隔0.5mM进展一系列太低 应，确定对于每个模板和引物对的最正确试剂盒不需优化镁离子浓度。介于0.1μM到0.5μM之低 间。为了准确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸取值和消光系数计算浓度。〔见公式1〕选择优质酶选择hotstartTaq酶进展扩增，可提进展扩增 高灵敏度，增加产量，降低干扰因素退火温度太使用表4的公式估算Tm，把退火温度设高 由于这些公式只是估算Tm些或低些。PCR承受无菌无酶无热源的离心管进展试剂的分装和使用。定量 引物、探针反响成分是否漏加；确定反响条件是否PCR性比照原来合成质无扩增量已阅历

题还是体系的问题；〔优化好

确认体系：1、引物是否降解〔看扩增产来推断引物和酶功能；2〔DNase处理TaqMan的体系〕 验荧光是否增加〕。仪器是否正常工作定量 模板或PCR隔离污染来源，更换试剂。阴剩余污染性比照线

使用UNG/dUTP使用专用的精巧移液器。在无DNA的吸头。体系有问题酶浓度不对，Mg离子浓度不对定量 引物二聚体检查引物设计和合成环节，必要时更改PCR〔染多 引物料法出更换热启动热启动酶能增加反响的特异性，提高灵现非特酶 敏度异信号〔此时引〕定量 无cDNA合RT-PCR成无扩增cDNA合成降低保温温度产量 温度太高相对荧反转录cDNA提高保温温度。重设计引物光信号产物被二级小于等构造封闭于背景RNARNA或没有害或降解模板对RNAse污维持无菌条件；参加RNase抑制剂照 染荧光探针无确保探针设计的有效性和fluorophore功能和quencher用DNase处理TaqMan否增加。必要的话设计和合成探针。灵敏度初始模板RNA10ng-1µg低RNA总RNA须在比预期更RNA被损害和降解必要的话更换RNA高的循RNAseRNase环中检染出产物无效