面上项目标书范例

申请代码H1606受理部门收件日期受理编号国家自然科学基金申请书()您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据下列三个环节操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顾客，请把Word宏的安全性设为:"中"办法:Word菜单->工具->宏->安全性->安全级,设立为"中"(如果您是Word97顾客，继续执行下列环节)(如果您是Office顾客，点击word左上角"安全警告"处"选项"中的"启用此内容")2)关闭本文档，重新打开本文档3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据下列三个环节操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顾客，请把Word宏的安全性设为:"中"办法:Word菜单->工具->宏->安全性->安全级,设立为"中"(如果您是Word97顾客，继续执行下列环节)(如果您是Office顾客，点击word左上角"安全警告"处"选项"中的"启用此内容")2)关闭本文档，重新打开本文档3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了亚类阐明：附注阐明：项目名称：Pyk2增进肝癌细胞迁移的一种新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依靠单位：通讯地址：邮政编码：266021单位电话：电子邮箱：申报日期：201FORMTEXT0年FORMTEXT2月FORMTEXT26日国家自然科学基金委员会

基本信息yoKWT/OQ申请人信息姓名性别男出生年月1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月）8电话电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址工作单位重要研究领域肿瘤分子生物学依靠单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称项目基本信息项目名称资助类别面上项目亚类阐明附注阐明申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤基地类别研究年限1月—12月研究属性基础研究申请经费35.0000万元摘要(限400字)：FORMTEXTE-cadherin的丧失与肝癌转移亲密有关。其丧失的重要因素是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。我们通过酵母双杂交发现一种新的能与E-cadherin互相作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增强可增进肝癌细胞迁移。本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。本课题设计首先通过GSTpulldown、免疫共沉淀证明两者互相作用可靠；另首先通过磷酸化实验确证Pyk2能够磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验拟定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中两者体现的有关性以及与转移的关系。本课题新发现Pyk2能够直接磷酸化E-cadherin，增进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，含有国际先进性。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药品研发提供新的思路。关键词(用分号分开，最多5个)FORMTEXT肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算根据与阐明）一.研究经费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb3:b3)+sum(tbl_budgetb9:b9)+sum(tbl_budgetb12:b12)+sum(tbl_budgetb15:b16)28.7528.7500FORMTEXT1.科研业务费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb4:b8)7.67.6000FORMTEXT（1）测试/计算/分析费FORMTEXT2.1000FORMTEXTDNA测序，生物信息分析，统计分析（2）能源/动力费FORMTEXTFORMTEXT1FORMTEXT（3）会议费/差旅费FORMTEXT1.0000FORMTEXT参加学术会议3-4人次（4）出版物/文献/信息传输费FORMTEXT3.0000FORMTEXT文献检索，发表论文，专利申请（5）其它FORMTEXT1.5000FORMTEXT成果鉴定2.实验材料费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb10:b11)21.1521.1500FORMTEXT（1）原材料/试剂/药品购置费FORMTEXT17.1500FORMTEXT多个试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材（2）其它FORMTEXT4.0000FORMTEXT动物喂养，临床调研3.仪器设备费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb13:b14)00.0000FORMTEXT（1）购置FORMTEXTFORMTEXT（2）试制FORMTEXTFORMTEXT4.实验室改装费FORMTEXTFORMTEXT5.协作费FORMTEXTFORMTEXT二.国际合作与交流费FORMTEXT=sum(tbl_budgetb18:b19)1.51.5000FORMTEXT1.项目构组员出国合作交流FORMTEXTFORMTEXT2.境外专家来华合作交流FORMTEXT1.5000FORMTEXT邀请美国康奈尔大学关军林专家合作交流三.劳务费FORMTEXT3.0000FORMTEXT硕士加班补贴四.管理费FORMTEXT1.7500FORMTEXT5%管理费合计FORMTEXT=sum(tbl_budgetb2:b2)+sum(tbl_budgetb17:b17)+sum(tbl_budgetb20:b21)3535.0000FORMTEXT与本项目有关的

其它经费来源国家其它计划资助经费FORMTEXT其它经费资助（含部门匹配）FORMTEXT其它经费来源累计FORMTEXT=sum(tbl_budgetc23:c24)00.0000 报告正文一、立项根据与研究内容：（一）项目的立项根据原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球全部肝癌病例的二分之一左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的重要因素。理解肝癌侵袭转移的有关机制，对于设计合理的治疗药品，进一步提高我国肝癌的治疗水平含有重要意义[2]。E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可无视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反映，介导细胞间的接触克制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功效[3]。E-cadherin与多个肿瘤的浸润转移亲密有关[4-5]。有人认为提高E-cadherin的体现能够成为肿瘤治疗的一种方向[6]。与其它肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率明显低于癌旁组织及正常肝组织，体现越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。有人报道缺少E-cadherin体现的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，阐明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。E-cadherin丧失或低体现的机制至今仍然不是完全清晰。现在认为可能是由于基因突变造成功效丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14]。那么有多少酪氨酸激酶参加这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin磷酸化的调节机制现在仍然不是非常明确。为理解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一种新的能与E-cadherin互相作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2与否能磷酸化E-cadherin并调节细胞迁移呢？Pyk2(prolinerichtyrosinekinase2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多个肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明，Pyk2在59%的肝癌组织中体现上调，Pyk2高体现与肝癌组织体积、Edmonson分级呈正有关，Pyk2体现越高病人预后越差。动物实验显示在侵袭边沿的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高体现。肝癌细胞株转染Pyk2后，其迁移功效增强；而用裸鼠做实验发现克制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[19-20]。Pyk2调节肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[19-20]；也有报道Pyk2与PECAM-1（血小板/内皮细胞粘附分子，与E-cadherin同样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[21]；尚有报道RhoC通过激活Pyk2增进前列腺癌转移[18]以及与SOCS3、Cyr61有关等[22-23]。总而言之，现在Pyk2调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清晰。Pyk2与E-cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。我们继续应用酵母双杂交重复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明两者互相作用是可靠的（具体成果见研究基础）。那么，现在的问题是两者在体内状态下与否结合？结合后的调节机制是什么？两者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞迁移以及影响肿瘤转移？考虑到Pyk2是一种激酶蛋白，我们的前期工作发现E-cadherin与Pyk2的激酶部分结合，因此有两种可能性。一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种就是E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。我们认为第一种可能性较大。有文献报道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族组员）并且克制其与Catenin，P120等形成复合体[24-25]。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应当也有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2体现增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使细胞迁移性增强。但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性，从而造成肿瘤细胞侵袭性下降。申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一种组员γ-Protocadherins能够克制Pyk2的活性[26]，申请人做这方面工作时曾取E-cadherin做对比参考，成果发现克制Pyk2激酶活性不是很明显（本数据未发表），因此不支持第二种可能性。两者具体如何调节还需要进一步实验来证明。本课题的设计重要是为理解答上述问题。首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能互相作用以及调节机制；另首先应用细胞迁移实验拟定两者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确两者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中两者体现的有关性以及与转移的有关性。本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接互相作用，并且拟定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。许多新型抗癌药品如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶为治疗靶点，获得非常好的疗效。本研究对于拟定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药品能够提供更有利的素材。参考文献：[1]HeJ,GuD,WuX,etal.MajorcausesofdeathamongmenandwomeninChina.NEnglJMed;353:1124–34.[2]吴孟超，廖美琳，陆嘉德常见恶性肿瘤治疗进展上海科技教育出版社[3]BryantDM,StowJL.TheinsandoutsofE-cadherintrafficking.TrendsCellBiol.Aug;14(8):427-34[4]WellsA,YatesC,ShepardCR.E-cadherinasanindicatorofmesenchymaltoepithelialrevertingtransitionsduringthemetastaticseedingofdisseminatedcarcinomas.ClinExpMetastasis.;25(6):621-8.EpubJul4[5]SalonC,LantuejoulS,EyminB,etal.TheE-cadherin-beta-catenincomplexanditsimplicationinlungcancerprogressionandprognosis.FutureOncol.Oct;1(5):649-60[6]HowardEW,CammKD,WongYC,etal.E-cadherinupregulationasatherapeuticgoalincancertreatment.MiniRevMedChem.May;8(5):496-518.[7]GuoC,LiuQG,YangW,etal.Relationamongp130Cas,E-cadherinandbeta-cateninexpression,clinicopathologicsignificanceandprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma.HepatobiliaryPancreatDisInt.Oct;7(5):490-6.[8]ZhaiB,YanHX,LiuSQ,etal.ReducedexpressionofE-cadherin/catenincomplexinhepatocellularcarcinomas.WorldJGastroenterol.Oct7;14(37):5665-73.[9]FransveaE,AngelottiU,AntonaciS,etal.Blockingtransforminggrowthfactor-betaup-regulatesE-cadherinandreducesmigrationandinvasionofhepatocellularcarcinomacells.Hepatology.May;47(5):1557-66.[10]OsadaT,SakamotoM,InoY,etal.E-cadherinisinvolvedintheintrahepaticmetastasisofhepatocellularcarcinoma.Hepatology.1996Dec;24(6):1460-7[11]AuerkariEI.Methylationoftumorsuppressorgenesp16(INK4a),p27(Kip1)andE-cadherinincarcinogenesis.OralOncol.Jan;42(1):5-13.[12]WeiY,VanNhieuJT,PrigentS,etal.AlteredexpressionofE-cadherininhepatocellularcarcinoma:Correlationswithgeneticalterations,β-cateninexpression,andclinicalfeaturesHepatology

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（二）项目的研究内容、研究目的,以及拟解决的核心科学问题。１.重要研究内容1）拟定E-cadherin与Pyk2体外、体内互相作用、作用位点以及调节关系。A．取E-cadherin与Pyk2不同构造域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的办法拟定两者互相作用的构造域，以及作用位点。B.选用两者体现量都适中的肝癌组织，行内源性免疫共沉淀，证明在体内两者也互相作用。C.应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心办法分析细胞组分的办法拟定E-cadherin与Pyk2在细胞中共定位。D.应用磷酸化实验，拟定E-cadherin与否是Pyk2的底物，应用定点突变的办法，拟定酪氨酸的磷酸化位点。（同时再次确证E-cadherin能否影响Pyk2激酶活性。）2）从细胞水平拟定Pyk2对E-cadherin的调节影响细胞迁移。A.筛选Pyk2稳定体现细胞株，然后应用Transwell细胞迁移实验观察过体现Pyk2的细胞其迁移性、侵袭性的变化，检测过体现Pyk2时E-cadherin的磷酸化状态和蛋白水平的变化，拟定Pyk2对E-cadherin磷酸化状态的调节影响细胞迁移。B.取高转移肝癌细胞株MHCC97-H、HCCLM3(购自上海中山医院肝癌研究所)，应用RNAi技术沉默Pyk2的体现，观察细胞迁移性、侵袭性的变化，检测对应状态下E-cadherin的磷酸化状态和体现水平的变化。从相反方向拟定Pyk2的体现克制后对E-cadherin磷酸化状态的调节，以及这种调节对细胞迁移的影响。3）从动物模型水平拟定Pyk2对E-cadherin的调节影响肿瘤转移。应用Pyk2稳定体现细胞株接种裸鼠，观察裸鼠肿瘤肺转移肝转移状况，分析Pyk2的过体现对E-cadherin磷酸化状态的调节关系，以及与肿瘤转移的有关性。4）从肝癌病人标本中寻找Pyk2与E-cadherin磷酸化状态的有关性，以及与肿瘤转移的的有关性。收集肝癌标本，应用免疫组化和Western等办法拟定Pyk2的体现水平的变化与E-cadherin磷酸化状态和蛋白水平的有关性，以及两者与肿瘤转移的有关性。２.研究目的1）拟定Pyk2结合E-cadherin互相作用的构造域及磷酸化位点，并阐明其调节机制。2）拟定Pyk2与E-cadherin的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。３.拟解决的核心科学问题E-cadherin酪氨酸残基的磷酸化造成其被降解，增加细胞侵袭性。本课题能够拟定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2与E-cadherin的调节与否是调节肿瘤细胞转移的新的分子机制。（三）拟采用的研究方案及可行性分析。１.研究办法GST-pulldown，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定体现细胞株的筛选，RNAi克制Pyk2体现，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。２.核心技术阐明：1）磷酸化实验首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参考，以纯化的GST-E-cadherin蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2与否能够磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin，则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察与否能够影响Pyk2的激酶活性。2）细胞迁移实验首先分别用空载体PCDNA3.1，PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的C段，为Pyk2的失活突变体），用G418筛选出稳定体现细胞株。并检测稳定体现细胞株Pyk2蛋白体现量的不同。然后应用稳定体现细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验，比较细胞迁移率的变化；检测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋白体现量的关系。同时取对应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白体现量的关系。3）裸鼠成瘤肿瘤转移实验取上述三组稳定体现细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星期左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移状况和肺转移状况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白体现量的不同以及与肿瘤转移的关系。同时取对应肿瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化，拟定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋白体现量的关系。4）蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检测。如果两者体现最多的峰值是在同一种组分中，则提示我们两者在细胞内是共定位的。取上述两者的体现较多的组分，用Pyk2单抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作对照），然后用E-cadherin单抗杂交检测E-cadherin与否能与Pyk2共沉淀下来。相反方向则是：用E-cadherin单抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作对照），然后用Pyk2单抗杂交检测Pyk2与否能与E-cadherin共沉淀下来。３.技术路线（见下图）定点突变，定点突变，GST-pulldown，免疫共沉淀等办法验证拟定互相作用的构造域以及位点荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等办法验证在细胞以及肿瘤组织中共定位收集肝癌病人标本和临床资料免疫组化、Western等办法检测E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2体现量的有关性，以及与肝癌转移的有关性。磷酸化实验拟定E-cadherin与否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点细胞迁移实验:测Pyk2蛋白过体现和RNAi克制时与E-cadherin磷酸化水平、细胞迁移的关系。筛选稳定体现Pyk2肝癌细胞株，检测Pyk2蛋白体现量与E-cadherin磷酸化水平的关系。裸鼠成瘤转移实验:Pyk2蛋白体现量、E-cadherin磷酸化水平与肿瘤转移的关系。汇总分析数据：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin机制；揭示Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。左侧部分：取E-cadherin与Pyk2不同构造域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的办法拟定两者互相作用的构造域，以及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等办法验证两者在细胞以及肿瘤组织中共定位；磷酸化实验拟定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度拟定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子机制。中间部分：通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型拟定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western等办法检测E-cadherin/Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析两者体现量的有关性，以及与肝癌转移的有关性。最下面部分为汇总数据，总结分析。4.可行性分析前期实验已经从酵母双杂交、GST-PullDown、免疫共沉淀等证明了E-cadherin与Pyk2互相作用(见研究基础部分)，并且两者功效上亲密有关。E-cadherin作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触克制方面含有作用。而Pyk2能通过多个信号途径参加调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，两者在功效上是有互相作用基础的。考虑到Pyk2是一种激酶蛋白，且前期实验成果提示Pyk2激酶区域结合E-cadherin，因此有两种可能，一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种是E-cadherin克制Pyk2激酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且克制其与Catenin、P120等形成复合体，从而影响细胞迁移。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应当就有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2体现增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证明Pyk2磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2过体现，检测E-cadherin磷酸化增强，蛋白量减少，造成细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi克制Pyk2的体现，则出现相反的成果，E-cadherin磷酸化削弱，蛋白量增加，造成细胞侵袭性削弱和肿瘤肺转移减少。事实与否如此，需要实验来证明。申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一种组员γ-Protocadherins能够克制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin克制Pyk2的活性，在肿瘤条件下，由于其它因素E-cadherin减少或消失，而不能克制Pyk2活性，造成Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要变化为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物，观察E-cadherin对Pyk2激酶活性与否有克制作用。然后筛选E-cadherin过体现、功效失活突变体和空载体的稳定体现肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过体现或功效失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白体现量及磷酸化水平有关性。但是申请人在完毕γ-Protocadherins克制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参考，成果发现E-cadherin克制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。2）本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作构建的质粒体现载体等为本课题的下一步研究提供了诸多有利的条件。本课题组的组员对所需要的技术办法都很纯熟，且都有对应的工作基础，能够在各个方面进行协作。3）本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都含有。（四）本课题的特色与创新之处1.本课题通过酵母双杂交新发现一种与E-cadherin互相作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的互相作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，含有国际先进性和独创性。（有报道两者的体现量与肿瘤转移的关系，但是两者直接互相作用未见报道。）2.本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此含有独创性和先进性。（五）年度研究计划及预期研究成果1.年度研究计划.01-.12磷酸化实验拟定两者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀拟定互相作用可靠，同时拟定两者结合的构造域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度超速离心，荧光共定位等有关的实验进一步确证两者共定位。同时收集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。.01-.12细胞迁移实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测Pyk2的体现与E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，拟定其调节机制。同时完毕E-cadherin/Pyk2的体现以及磷酸化状态与肝癌的分期、转移、预后、复发等临床指标的有关性分析。.01-.12补充实验遗漏，整顿实验资料，统计解决实验数据，撰写论文。2.预期研究成果1)拟定Pyk2能够磷酸化E-cadherin，以及两者互相作用的构造域以及磷酸化位点。2)拟定Pyk2通过磷酸化E-cadherin，从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。3)拟定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2体现量的有关性，以及两者的体现与肝癌转移的有关性。4)在国外学术期刊上发表SCI论文2-4篇，其中影响因子不不大于5的有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。5)培养硕士2-3名。二、研究基础与工作条件（一）研究基础第一步：为了研究肝癌转移的机制，首先选用E-cadherin（胞内段，下列实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交，寻找与E-cadherin互相作用的蛋白。我们先选用的是LACZ系统蓝白斑筛选，但是由于背景高而放弃。后来选用CytoTRAP系统，背景明显减低，测序后故意义的基因有31个。其中有4个为Pyk2片段。通过克隆Pyk2基因全长验证，拟定两者在酵母中的互相作用是强阳性的（图1）。（同时验证Pyk2的同源蛋白FAK与E-cadherin互相作用为可疑弱阳性）。图1酵母双杂交（CytoTRAP系统）验证Pyk2与E-cadherin互相作用pMyr-Lamin为阴性对照，pMyr-SB为阳性对照，E-Cad为E-Cadherin缩写，下列图示与此相似。Psos-E-Cad为诱饵蛋白。CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不互相作用在25℃时能够生长，而在37℃则不能生长,如阴性对照pMyr-Lamin所示。两个蛋白如果互相作用则在两个温度下都能生长,如阳性对照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2与阳性对摄影似。第二步：原核体现E-cadherin和His-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证两者是直接结合，我们分别细菌中体现纯化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全长非常难纯化，得不到纯化的蛋白。我们体现纯化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown实验成果证明Pyk2的激酶部分能够与E-cadherin直接结合（图2）。泳道123图2原核体现E-cadherin和His-Pyk2激酶部分进行GST-Pulldown。分别原核体现GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相似量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用his抗体Western检测，成果显示His-Pyk2激酶部分能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），泳道1上图是纯化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作为检测原则。第三步：原核体现E-cadherin和细胞体现Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。我们转染Myc-Pyk2于SYF细胞（SYF细胞株是酪氨酸激酶c-Src,Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成