木霉制剂对土壤定殖动态及微生物数量的影响

木霉制剂对土壤定殖动态及微生物数量的影响

香蕉萎缩，也称为棕榈树病和黄叶病，是由头孢菌c.c.c.感染引起的。这是土壤传播的一种毁灭性疾病。近年来在海南、广东、广西等香蕉主产区枯萎病的发生日趋严重。目前单纯采用化学药剂防治香蕉枯萎病的效果并不理想,农药的过量使用还会造成土壤中农药残留和环境污染,影响土壤质量,导致土壤微生物群落结构失衡。因此利用木霉(Triochodermaspp.)等生防菌防治香蕉枯萎病的生物防治技术逐步受到重视。然而木霉等生防菌在土壤中的定殖过程容易受到诸多自然因素的影响,因此,多数木霉制剂的研究仍停留在实验室阶段。本试验初步研究了木霉在土壤中的动态变化以及木霉制剂对土壤微生物数量的影响,为木霉制剂的田间应用和香蕉枯萎病的生物防治提供理论依据。1材料和方法1.1培养基na培养基:真菌分离用孟加拉红培养基,配方为:葡萄糖10g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,孟加拉红0.033g,0.1g氯霉素,琼脂15g,水1L。细菌分离用牛肉膏蛋白胨培养基(NA),配方为:牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂15g,水1L,pH7.0。木霉制剂:特克德菌木霉菌粉剂(台湾地球村生态有限公司生产);自制木霉菌剂为作者筛选的9株木霉菌株,经木薯渣发酵配制而成(孢子浓度为107CFU/g)。土壤消毒剂:50%氰氨化钙颗粒剂(荣宝牌,宁夏大荣实业有限公司生产)。1.2香蕉根围土样的采集试验在广西农业科学院微生物研究所玻璃温室内进行。从南宁市武鸣县香蕉种植园随机采回耕作层土壤,混匀后分成2份,其中1份经高压灭菌(121℃,0.1MPa,60min)后装盆(盆高22cm,直径20cm),另一份为自然土壤作对照。每盆施入150g自制木霉菌剂,与盆中土壤混匀,然后移栽1株叶片数为5～6张、长势一致的脱毒组培蕉苗。每隔2～3d淋水1次,保持土壤湿度,每个处理设3次重复。处理7d后进行香蕉根围土样的第1次采集,之后各处理每隔7d采集1次土样,共采集9次。称取10g土样至装有90mL无菌水的灭菌三角瓶中,在涡旋器上充分震荡1min,制成土壤悬浮液,做10倍浓度梯度稀释至10-4,用微量移液器从10-2、10-3、10-4稀释液中各取0.1mL,分别涂布至孟加拉红培养基平板上,28℃下倒置培养。36h后,对平皿上直径5mm左右的白色单菌落进行计数,计算土样中木霉数量。每克土样含菌数量(CFU/g)=单菌落数×10×稀释倍数1.3蕉苗和蕉苗处理田间试验在广西武鸣县锣圩镇那则村培联屯进行,该地长年种植西贡蕉,历年枯萎病发生严重。试验区香蕉种植株行距为2.81m×2.93m,每公顷植1425株,共设置3个处理:Ⅰ,自制木霉菌剂;Ⅱ,特克德菌木霉菌粉剂;Ⅲ,CK。蕉苗移栽前,2012年6月5日,处理区Ⅰ和处理区Ⅱ用50%氰氨化钙颗粒剂对土壤进行消毒处理,用量为每公顷900kg,随后用地膜覆盖。6月29日揭膜移栽蕉苗,并进行第1次菌剂处理。处理Ⅰ每株蕉苗根围施入3kg自制木霉菌剂,处理Ⅱ每株蕉苗根围施入与处理Ⅰ含有相同当量孢子的特克德菌木霉菌粉剂,培土覆盖,适当淋水定殖,CK不进行土壤消毒也不施木霉制剂作为对照,分别于8月21日和10月23日进行第2次和第3次处理,方法同第1次。以上每处理3次重复。1.4细菌、真菌数量测定分别于2012年6月29日、8月21日和10月23日当天菌剂处理之前,在香蕉根围采集耕作层土壤样品,用于检测土壤中细菌和真菌的数量。按五点采样法采集土壤约100g,混匀后带回实验室检测。称取10g土样至装有90mL无菌水的灭菌三角瓶中,在涡旋器上充分震荡1min,制成土壤悬浮液,做10倍浓度梯度稀释至10-6。土样细菌数量测定:用微量移液器从10-4、10-5、10-6稀释液中各取0.1mL,分别涂布至NA培养基平板上,28℃下倒置培养,每份3次重复;24h后选择每皿出现30～100个菌落的平板,对培养基上肉眼可见的细菌单菌落进行计数,计算土样细菌数量。土样真菌数量测定:用微量移液器从10-2、10-3、10-4稀释液中各取0.1mL,分别涂布至孟加拉红培养基平板上,28℃下倒置培养,每份3次重复;36h后选择每皿出现30～100个菌落的平板,对培养基上肉眼可见的真菌单菌落进行计数,计算土样真菌数量。每克土样的含菌数量计算方法同1.2。1.5发病率和防治效果2012年12月10日,调查香蕉枯萎病发病情况,记录试验区每株香蕉是否感病,计算各处理小区发病率和防治效果。发病率(%)=感病株数总株数×100(%)=感病株数总株数×100相对防效(%)=对照区发病率−处理区发病率对照区发病率×100(%)=对照区发病率-处理区发病率对照区发病率×1002结果与分析2.1不同土中木霉数量的变化如图1所示,木霉在灭菌土壤和自然土壤中的数量总体变化趋势大致相同,短期内上升而后逐渐下降;在14d前上升趋势明显。所不同的是,木霉在灭菌土中的最高数量可维持相当长的时间,在第14天至第28天之间无明显变化;而自然土中的木霉数量自第14天达到峰值后便开始逐渐下降。在灭菌土中,木霉数量在28～35d之间迅速下降,但自35d之后直至试验结束的第63天,其数量仍高于第7天时的数量。而在自然土中的木霉数量自第49天起便开始低于第7天的数量。总体上,在整个试验周期内灭菌土中的木霉数量始终高于自然土。2.2土壤细菌数量木霉制剂在田间施用时,香蕉根围土壤中的细菌数量结果见表1。第1次处理前(6月29日)检测结果显示,处理区土壤细菌数量与对照区相当。两次处理后(8月21日和10月23日)检测结果显示,处理区土壤细菌数量略高于对照区,但未达显著水平。各处理的细菌数量均以8月21日为最高,这可能与7、8月份地温较高,雨量较为充沛,土壤环境更适于细菌生长繁殖有关。2.3土壤真菌数量的变化木霉制剂田间施用后,香蕉根围土壤真菌的检测结果见表2。第1次处理前(6月29日)检测结果显示,各处理区土壤真菌数量与对照区相当。第1次处理后(8月21日)的检测结果显示,处理Ⅰ和处理Ⅱ的土壤中的真菌数量明显增加,分别为10.98×104和6.01×104CFU/g,极显著高于对照区。第2次处理后(10月23日)的检测结果显示,处理Ⅰ的土壤真菌数量又有显著上升,增加至19.06×104CFU/g;处理Ⅱ中的土壤真菌数量增加不明显,但仍显著高于对照区。2个施入木霉制剂的处理土壤中,真菌的数量均显著增加;其中,又以施入自制菌剂处理的土壤真菌数量增加更为明显。2.4霉菌制剂处理前后血糖的比较12月10日,调查香蕉枯萎病发病情况,结果见图2。自制木霉菌剂处理区和木霉菌粉剂处理区的发病率分别为13.8%和20.6%,明显低于对照区的发病率(37.8%)。2种木霉制剂对枯萎病均有一定防效,但自制木霉菌剂处理区的防效(63.5%)明显高于木霉菌粉剂处理区的防效(45.5%)。3木霉菌剂在土壤中的定殖在土传病害的生物防治实践中,生防菌在土壤中能够成功定殖并长期占领有利的生态位点是获得较好防治效果的关键因素之一。本研究结果显示,木霉在灭菌土壤中的定殖能力明显好于非灭菌的土壤。因此在施用木霉菌剂前,先对土壤采取各种消毒处理,降低其他杂菌在土壤中的数量,当木霉施入土壤中时,便可较好定殖,成为土壤微生物中的优势群体,改善土壤的微生态环境,有效抑制病原菌的生长,这与邱登林等的研究结果相一致。同时,应注意在采取土壤消毒措施后,在相应的杀菌剂残效期消除后,尽快施入木霉制剂。否则经杀菌剂处理的土壤中各种微生物数量会在杀菌剂作用减弱时迅速增长,而失去木霉占领有利生态位的最佳时机。与木霉菌粉剂相比,自制木霉菌剂在土壤中定殖快、数量多。这是由于自制的木霉菌剂采用木薯渣等农业废弃物为基质,这些基质富含淀粉、纤维素和蛋白质等营养物质,为木霉