烟草赤星病菌株的分类鉴定与致病力测定

烟草赤星病菌株的分类鉴定与致病力测定

牧草赤星病是牧草生长后期的主要疾病之一。我国自60年代先后在河南、山东省较大流行以来,其后陆续在各烟区普遍发生,近年此病在广东、云南等省均上升为烟草生产上头等重要病害,损失严重。已有的研究对此病病原菌种的分类看法不一,但国内多数学者趋向于链格孢菌(A.alternata)和长柄链格孢菌(A.longipes)。本研究旨在弄清云南烟草赤星病病原的种类和分布,主要生物学特性及致病力,筛选高效、低毒、低残留的防治药剂,为烟草赤星病的流行学和防治学提供科学依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株筛选和培养在云南省玉溪、曲靖、楚雄和大理四个烟草生产区采集病斑典型,且仅此一种病害的病叶(茎),按常规方法分离培养,共获得80多个菌株,经纯化镜检和培养性状测定,从每烟区各筛选出3个在形态和培养性状上具代表性的菌株,其代号分别为玉溪的YX01B,YY26B,YY30B,曲靖的QJ3A,YJ03,YJ30A,楚雄的CX10,CX6,CX7,大理的YQ16A,X02A,X09C.用PDA(PH5.8～6.2)平板和斜面培养待用。1.1.2种子消毒液“株”以该省普遍种植的烟草品种红花大金元为材料(由西南农大农学系提供),将已精选的种子用1%的硫酸铜溶液浸泡10分钟,催芽、播种于盘内消毒土中,2片真叶时转移到盛消毒珍珠土的塑料钵中,每钵一株;5-6片真叶时移栽入盛消毒土的瓦钵中,每钵一株;常规管理待用。1.1.3供试农药及药剂从30多种高效、低毒、低残留、内吸性、广谱性、易降解的国内外农药中初筛出以下三种药剂供试:1.50%扑海因粉剂,重庆植保站提供。2.70%甲基托布津粉剂,省农科院植保所提供。3.10%西奇爱乳剂,四川省农科院植保所提供。1.2方法1.2.1测分生孢子鉴定将筛选的12个供测菌株在PDA平板上常规培养,待充分产孢后,在光镜下分别测量和观察各菌株的分生孢子,咀孢和分生孢子梗大小、形状、颜色、着生状况和分隔情况,并按咀孢长度少于分生孢子长度1/3为链格孢菌和咀孢长度大于或等于分生孢子长度1/3为长柄链格孢菌的分类标准鉴定各菌株种类,显微摄影。1.2.2升温培养各菌株取5cm直径菌块转移到PDA平板中心,分别在5℃,10℃,15℃,20℃,24℃,28℃,32℃和38℃,8个温度梯度下恒温培养,三次重复。7天后,测菌落直径和气生菌丝高度,观察菌落大小、形状、颜色和底色等特点。1.3刺槐的培养当烟草长到8-9片真叶时,各菌株分别配制成浓度为5×104个孢子/ml的悬浮液,用针刺法接种到烟苗的下部三片叶上(叶中脉两边各刺3下,每个菌株3次重复,以灭菌水针刺为对照)。接菌后用薄膜将各烟草相互隔离,并保湿48小时,7天后按董汉松等分级标准调查发病情况计算发病率和病情指数,确定各菌株致病力强弱和该烟草品种对各菌株的反应型,用柯赫氏证病律进行菌株验证。1.4种药剂的配制及对比药剂的毒力程度用ED50表示,以采自云南、大理和曲靖地区的X09C和YJ30A分别代表链格孢菌和长柄链格孢菌菌株进行研究,将上述三种药剂配成不同浓度梯度(表2)的PDA培养基,接菌培养、观察,各三次重复;用生长速率测定法和计算器机率值分析法测定各药剂在不同浓度下对X09C和YJ30A的抑制率(菌落大小抑制百分率)。计算ED50求出回归方程,并进行适合性检验。抑制率%=对照菌落直径−处理菌落直径对照菌落直径×100%%=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径×100%2结果与分析2.1联轴高断序1/3对12个供试菌株鉴定结果:玉溪的YY26B,曲靖的YJ30A和楚雄的CX6为长柄链格孢菌。分生孢子尺度为7.4-40.8×7.4-21.2μm。倒棒锤形或椭圆形,褐色或黑褐色,单生或串生于分生孢子梗上,有纵横分隔,纵隔0～3个,横隔1～9个,有的稍弯曲,接近孢子梗的分生孢子较大。孢子链末端的孢子较小,椭圆形或豆形,只有一个横分隔,咀孢较长,大于孢长度的1/3;多数几乎与孢子等长,有时可达孢子长度的2倍,其尺度为3.0-5.66×3.4-6.2μm,褐色,具0-3个横分隔,分生孢子梗线形,其尺度为4.9-123.0×3.4-5.4μm,褐色、丛生或散生,顶端弯曲,具有0～6个横分隔。其余9个菌株均为链格孢菌,其分生孢子尺度为10.3-49.2×6.2-22.1μm,椭圆形,倒棒锤形或长圆筒形,褐色、黑褐色或墨绿色,单生或丛生,有纵横分隔;纵隔0～3个,横隔1～9个,有时稍弯曲,接近孢子梗的孢子较大。孢子链末端的孢子较小,椭圆形或豆形,只有一个横分隔,咀孢有或无,褐色或黑绿色,长短不一,但通常不超过孢子长度的1/3,其尺度为0-24.6×2.5-8.6μm,常不分隔,只有部份具1～3个横隔,分生孢子梗线形,尺度为2.5-123.0×2.5-6.4μm,褐色或墨绿色,丛生或散生,顶端弯曲,具0～6个横隔。由上可知,云南省烟草赤星病的病原有链格孢菌和长柄链格孢菌两种,其中多数为链格孢菌,大理标样均为链格孢菌,玉溪、曲靖和楚雄烟区两者都有,以链格孢菌居多。2.2培养期及培养期对赤星病菌生长的影响从图(1～6)可看出,链格孢菌和长柄链格孢菌的菌落相似,大多数为圆形,极少数为不规则形,有的具有与接菌点为中心的颜色不同的同心轮纹,有的中央隆起,随温度梯度升高和培养期延长,菌丝不断增加,并老化和产孢,使菌落由白色、灰色渐至墨绿色或黑褐色,气生菌丝也由白色渐至墨绿色,菌落底色基本上为墨绿和黑色,两种赤星病菌生长的最低温度为5℃,最适为24-28℃,最高为36℃,结果与近年国内外对链格孢菌和长柄格链孢菌的研究报导一致(图7)。2.3烟草金银花大金由表1可知,链格孢菌的9个菌株平均发病率和病情指数分别为56.8%和19.89%,长柄链格孢菌的三个菌株平均发病率和病情指数分别为33.3%和8.3%,因此,链格孢菌的致病力强于长柄链格孢菌,但在链格孢菌中,致病强弱差异很大。CX7的病情指数只29.8,属致病最弱的菌株,致病最强的是YY30B,次为YX01B(病情指数分别为38.9和33.3)X02A和X09C致病力也较强(病指数均为25.0)。表1还看出烟草红花大金元对链格孢菌各菌株多表现为感病和耐病,对长柄链格孢菌为抗病或耐病。经过柯赫氏证病律验证,烟苗接病菌后,产生的症状较典型,链格孢菌与长柄链格孢菌的症状相似,接种叶片上出现直径约0.5cm的褐色病班,病班具有同心轮纹,质脆,易穿孔,病斑边缘明显,外围有淡黄色晕环,从病斑上分离培养的病原进行镜检,与接种前各菌株的分生孢子,咀孢和分生孢子梗的形态特征一致,证明接种前后的菌种相同。2.4求各加回归方程通过生长速率测定法测得三种试验药剂各浓度下对烟草赤星病X09C和XJ30A的抑制率(见表2),经机率值分析法计算其ED50,求出回归方程(表3)。结果表明:三种药剂中