猕猴桃酒中的叶绿素及护色研究

猕猴桃酒中的叶绿素及护色研究摘要:绿色是果蔬及其部分制品的重要商品性状，本文通过对叶绿素的结构和稳定性的分析，以杨凌“秦美”猕猴桃为原料，对猕猴桃酒的护绿进行工艺优化，研究护绿剂、发酵温度、贮藏温度、光照条件对护绿效果的影响。分别测定叶绿素、类胡萝卜素的含量，结合感官评定选出较佳的护绿组合。关键词:叶绿素；护绿；猕猴桃酒果蔬的色泽是构成产品品质的重要因素,也是检验果蔬成熟衰老的依据,色泽不仅反映果蔬的新鲜度,还可促进人们的食欲,美丽天然的食品颜色是优质果蔬的一个重要特征。果蔬的绿色主要来源于叶绿素,叶绿素决定了产品的品质特征,同时还具有改善便秘、降低胆固醇、抗突变等生理功能。而叶绿素在果蔬贮藏、加工和货架期极易褪色或者变色,严重影响了产品质量,同时也大大降低了商品价值。猕猴桃是少有的几种成熟后还保持绿色的果实之一，在其制品中绿色是一个重要的商品性状，保持绿色就能提高其商品性状。1.叶绿素1.1叶绿素的化学结构和理化性质图1叶绿素分子结构及其模型叶绿素是高等植物进行光合作用的重要物质，结构为一个镁和四个吡咯环上的氮结合以卟啉为骨架的绿色色素的总称[1]。早在1818年，Berzelius就开始了对叶绿素的研究[2]。1933年美国以有机溶剂法为基础，开始工业生产叶绿素，此方法延用至今[3]。图1是叶绿素a的结构和模型。主要有叶绿素a和叶绿素b两种,在一些藻类中还有叶绿素c和叶绿素d。叶绿素是脂溶性色素,不溶于水,可溶于丙酮、乙醇和石油醚等有机溶剂,在颜色上,叶绿素a呈蓝绿色,叶绿素b呈黄绿色,它们的含量之比约为3∶1。叶绿素a和叶绿素b及衍生物的吸收光谱表明,它们在红光区(620~700nm)和蓝紫区(400~500nm)出现了较深的黑带,也就是说,这些光线被叶绿素强烈吸收;而在绿光区(520~580nm)没有黑带,即未被吸收,这也正是叶绿素是绿素的原因。戴荣继等人[4]采用紫外检测器和二极管阵列的三维检测器多次尝试后,最终确定叶绿素a的发射波长为433nm,激发波长为664nm;叶绿素b的发射波长为469nm,激发波长为670nm。1.2叶绿素的功能应用食品行业中用来分析叶绿素衍生物添加剂的含量以及食品的色泽。绿色食品近年来受到了人们广泛关注，而存在于绿色植物中的一种独特而重要的营养物质—叶绿素，它的一些生理功能也开始备受重视。叶绿素的结构和血红素极相似，易于被人体吸收，有赋活细胞的作用，在医药、食品和日化工业中有广泛用途，由于叶绿素为天然品，无毒副作用，长期食用安全、可靠，因此，FAO/WHO对叶绿素每人日允许摄入量未作规定。目前，叶绿素已广泛应用于口香糖、硬糖、果汁、琼脂、糕点等食品（但不能用于酸性或含钙食品，否则，易产生沉淀），日本已将其作为绿色色素用在食品添加剂中医药工业上叶绿素具有改善便秘、降低胆固醇、抗衰老、排毒消炎、脱臭、抗癌抗突变、抗贫血、保肝等功能，对皮肤组织有再生作用，可用于治疗烫伤，慢性溃疡，能抑制葡萄球菌和链球菌生长，对齿龈炎、口臭、中耳炎等有一定疗效。另外，叶绿素可以防治感冒，感冒患者可将叶绿素溶液内服涂口唇或含漱，每日数次，1～2d后症状可减轻。以叶绿素为原料研制治疗缺铁性贫血的叶绿素铁钠盐，提高白血球水平的叶绿素钴钠盐，增强智力和记忆力的叶绿素锌钠盐具有重要价值，由叶绿素制得的叶绿素铜钠盐更是生产治疗肝炎、胃病及十二脂肠溃疡药物的重要原料。叶绿素铜钠盐还是“肝宝”胶囊剂、“胃肝绿”片、“升血宝”、“胃康U”等药物的重要有效成分。日化工业中用作制造香皂、香水、护肤霜、香波及牙膏等产品。因此，叶绿素的市场前景非常广阔，而降低生产成本、简化提取工艺、加强对叶绿素活性的一系列研究将对果蔬产业化应用、食品科学、医药保健等领域产生深远影响[5~7]。1.3影响叶绿素稳定的因素果蔬中叶绿素的降解是其色泽退化的根本原因。影响叶绿素稳定的因素有很多，比如光、叶绿素酶、温度、pH、氧气、微生物以及金属离子等[8]。研究表明，光和氧气对叶绿素的降解具有极显著的影响，温度、pH等对叶绿素降解影响也较显著。1.3.1光光对叶绿素的降解机理，国内外已有大量的研究。在活体植物中，叶绿素可以得到很好的保护，不仅不会发生降解，还可以进行光合作用。但离体的叶绿素在光的作用下变为三线态，通过电子传递，产生自由基等活性氧而破坏蛋白质、碳水化合物及DNA等生物分子的结构，引起叶绿素分子的降解［9,10］。研究发现，紫堇叶绿素随着光照时间的增加，其光吸收值降低，同时叶绿素的颜色逐渐变浅，当光照时间大于4h时，紫堇叶绿素在430nm处的光吸收值明显降低。唐小俊等[11]在室外自然光、室内自然光和黑暗条件下对苦瓜叶绿素的光稳定性进行了研究，结果表明，苦瓜叶绿素对光非常不稳定，光越强，稳定性越差。胡秋娈等[12]对荠菜叶绿素光稳定性的研究和王敏等[13]对冬青叶绿素光稳定性的研究都得出相似的结果。1.3.2氧气在叶绿素的降解中占有重要地位，活性氧可使叶绿素四吡咯环碳环双键裂解，导致卟啉大环裂解，同时O2还能影响相关酶的活性，对叶绿素的降解具有显著性影响。许多文献报道，叶绿素的降解速率与氧气的浓度呈正相关，随着环境中氧气浓度的增加，叶绿素的褪色现象愈来愈严重。1.3.3温度对叶绿素的降解具有显著影响。研究表明，在不同受热温度条件下，叶绿素提取液的降解速率曲线有明显的拐点。一般认为，温度影响叶绿素降解的机理主要是影响果蔬体内各种酶的活性。如在青花菜中，叶绿素过氧化物酶的活性随温度的升高而升高，到达一定温度时，叶绿素的含量迅速降低。1.3.4叶绿素在中性和弱酸弱碱性条件下较稳定，研究表明，pH在6～11之间叶绿素的保存率高达90%。酸性过强会导致叶绿素脱镁而褪色明显，碱性过强则会加速脱酯反应使叶绿素分解，但碱性条件下叶绿素不会发生脱镁或碳环裂解反应，能保持相对稳定的色泽。1.3.5叶绿素酶大量研究证明，叶绿素酶在叶绿素酶促降解代谢的最初步骤中起作用，其最适反应温度为60～80℃，当温度大于80℃时，叶绿素酶活性下降，100℃时已完全失活。1.4护绿1.4.1降低体系的水分活度和贮藏温度果蔬中的水分活度可以影响微生物的繁殖、代谢和生存。当水分活度小于0.6时，果蔬在不需要冷藏的情况下可获得较长的货架期，色泽基本不变在低温条件下，叶绿素酶的活性大大降低。研究表明，果蔬中叶绿素b的降解速度在40℃时比25℃时快3.2～5.2倍，比4℃时快11～21倍。通过真空冷冻干燥可以在低温条件下降低果蔬中的水分活度使果蔬中的叶绿素得到最大限度的保留。1.4.2金属离子取代镁叶绿素分子卟啉环中的镁离子在酸性条件下被氢离子取代，生成黄褐色的脱镁叶绿素，但脱镁叶绿素分子中的氢离子被铜、锌、钙等金属离子取代，生成相应的叶绿素金属离子络合物，恢复为绿色，这种络合物对酸、热、氧气和光等的稳定性大大提高，可使叶绿素较长时间的保存。同时，在果蔬加工过程中，配合热烫处理，酸碱度调节等，可以达到很好的护绿效果。1.4.3染色技术叶绿素铜钠、叶绿素锌钠等是叶绿素的衍生物作为安全的天然食品添加剂，具有很好的护绿效果叶绿素铜钠呈蓝黑或墨绿色，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿，不溶于油脂，其耐光、耐热性强于叶绿素有一定的吸湿性。叶绿素锌钠呈墨绿色，水溶性好难溶于丙酮和乙醇，耐热性强，但耐光性较差，具有很好的抗氧化、还原性1.4.4其它护绿技术气调贮藏是在一定的温度和湿度条件下，通过控制贮藏环境中的气体成分，延缓果蔬的生长势，降低其呼吸强度，从而达到贮藏保鲜目的的贮藏方法。壳聚糖是一类涂膜保鲜剂，它可在果蔬表面形成半透膜，具有很好的护绿保鲜效果。盛玮等用高压脉冲电场处理果蔬，可以达到很好的护绿效果。其它护色技术还包括减压贮藏、真空包装或充氮包装，利用蜂胶护色保鲜等。1.5叶绿素的检测技术[14]叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、原子吸收光谱法和光声光谱法。快速测定的方法包括基于计算机视觉技术的叶绿素含量检测系统、快速检测仪如SPAD-502叶绿素仪。其中分光光度法具有准确度高的特点,是叶绿素含量测定过程中应用最为广泛的方法。因紫外分光光度法精确性高，所以GBT22182-2008油菜籽叶绿素含量测定就是使用的分光光度计法。紫外分光光度法测定叶绿素含量主要依据Arnon公式,其计算方法是:分别以提取溶剂作空白,测定叶绿素提取液吸光度A645、A663,根据下面的公式:Chla、Chlb、Chl和Car含量：紫外分光光度法测定。参照朱广廉等的方法，略有改进。计算公式如下：Chla（mg/mL）=（12.7OD663－2.69OD645）×25V（1～1）Chlb（mg/mL）=（22.9OD645－4.67OD663）×25V（1～2）Chl（mg/mL）=20.2(OD645＋8.02OD663）×25V（1～3）=（1～4）25为测吸光度时的溶液体积，单位mL,V为所取猕猴桃酒样的体积，单位mL。上述公式可以定量地说明叶绿素提取液受不同影响因子作用后的降解率。但是测试程序耗时，需要有经验的分析人员方能确保良好的数据及长期的一致性；且受多方面的因素影响。3.猕猴桃酒护绿工艺研究2.1猕猴桃酒加工工艺流程猕猴桃鲜果分选→清洗→去皮→破碎榨汁→酶解→下胶澄清→果汁成分调整→接种→避光发酵→猕猴桃发酵酒→澄清→贮藏→检验2.2猕猴桃果汁护绿剂的选择猕猴桃清汁分别加入不同浓度的CuSO4、(CH3COO)2Zn、EDTA-2Na、CaCl2，在散光照射，室温条件下，密封绝氧贮藏3d，测定叶绿素和类胡萝卜素的含量。具体操作如下：（1）每试管20ml的猕猴桃清汁，向5支试管中分别加入CuSO4，比例为：0.625mg/L、1.25mg/L、1.875mg/L、2.5mg/L、3.125mg/L、5mg/L，3组平行；空白组：20ml的猕猴桃清汁。（2）每试管20ml的猕猴桃清汁，向5支试管中分别加入(CH3COO)2Zn，比例为：16.9mg/L、33.8mg/L、50.7mg/L、67.7mg/L、101.5mg/L、135.4mg/L，3组平行；空白组：20ml的猕猴桃清汁。（3）每试管20ml的猕猴桃清汁，向5支试管中分别加入EDTA-2Na，比例为：10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L，3组平行；空白组：20ml的猕猴桃清汁。（4）每试管20ml的猕猴桃清汁，向5支试管中分别加入CaCl2138.75mg/L、277.5mg/L、555mg/L、1110mg/L、1665mg/L、2220mg/L，3组平行；空白组：20ml的猕猴桃清汁。2.3护绿剂的正交优化每组选出三个猕猴桃清汁护绿效果较好的浓度，进行4因素3水平的L9（34）正交优化，在散光照射、密封绝氧、室温条件下静置7d，测定叶绿素和类胡萝卜素的含量。2.4猕猴桃酒发酵温度的选择调整好成分，加入复合护色剂的猕猴桃清汁，接入猕猴桃酒发酵菌种分别在15℃、20℃、25℃、30℃和自然条件下绝氧避光发酵。2.5猕猴桃酒贮藏温度的选择将15℃避光发酵的猕猴桃酒分别于0℃、5℃、10℃、25℃下绝氧避光贮藏1个月。2.6猕猴桃酒贮藏器具的选择将15℃避光发酵的猕猴桃酒分别贮藏在透明玻璃瓶、棕色玻璃瓶、避光玻璃瓶中贮藏，贮藏温度25℃。2.7猕猴桃酒的感官评定结合QB／T2027～94,按GBl5038～2005规定方法，略有改动，对猕猴桃酒进行感官品评，评定指标见表2。表1猕猴桃酒感官评价Table1SensoryevaluationofKiwifruitliquor项目（Items）指标(Index)分数(Fraction)色泽(color)黄绿色，有光泽10外观(façade)澄清透明，无沉淀及悬浮物10香气(smell)有秦美猕猴桃的果香及纯正酒香40滋味(taste)口感协调、清新爽口、醇厚柔和、余味悠长30典型性(typical)有“秦美”猕猴桃酒的典型风味103.结果分析3.1护绿剂的选择对上述四个护绿剂每个因素取3个较佳护绿水平，因素水平表见表2所示：表2因素水平表Tab2Factorsandlevels序号因素A（CuSO4浓度/mg/L）B（(CH3COO)2Zn/mg/L）C（EDTA-2Na/mg/L）D（CaCl2/mg/L）11.25033.840111023.125101.560166535.000135.4802220由表3和表4并进行L9（34）数据分析如下：A、B、C、D4因素对猕猴桃清汁的护绿影响的主次顺序为D＞B＞C＞A，从实际测定值差异显著性分析可知，最优组合为D3B2C1A3。榨出猕猴桃果汁后，加入护绿剂最佳浓度为：CaCl22220mg/L、(CH3COO)2Zn101.5mg/L、EDTA-2Na40mg/L、CuSO45mg/L。表3L9（34）正交试验结果Table3L9（34）Orthogonaltest试样号SampleNumber因素与水平Factorandlevel叶绿素Chl（mg/mL）护绿率（%）A(mg/L)B(mg/L)C(mg/L)D(mg/L)11(1.25)1(33.8)1(40)1(1110)0.737952.30212(101.5)2(60)2(1665)0.578641.01313(135.4)3(80)3(2220)0.703649.8742(3.125)1230.739752.42522310.805657.09623120.5740.4073(5)1320.656646.53832130.861461.05933210.520436.88K1143.18151.25153.75146.17K2149.91159.15130.31127.94K3144.46127.15153.49164.34k147.7350.4251.2548.72k249.9753.0543.4442.65k348.1542.3851.1654.78R1.8210.677.8112.13表4方差分析结果Tab4Resultsofvarianceanalysis方差来源离差平方和自由度方差F显著性A1.25620.6288.814B13.65426.82795.818*C8.15224.07657.207*D15.12327.5615106.126**误差0.28520.1425注：F0.05（2，2）＝19.00；F0.01（2，2）＝99.00*显著**极显著(Note：F0.05（2，2）＝19.00；F0.01（2，2）＝99.00)3.2温度和贮藏容器的选择表5酒样感官评定Table5Samplewinesensoryevaluation酒样（Sample）色泽（Color）澄清度（Clarity）果香（Fruit）酒香(wine)滋味(taste)典型性（typical）总分（100）15℃9.28.516.61420.28.57720℃8.88.615.714.419.88.275.525℃71.430℃8.58.713.613.818.87.570.49自然条件6.28.314.514.319.07.569.8对不同温度发酵条件下的猕猴桃酒进行感官评定，具体结果见表5。由表5可知，酒1感官评分最高，色泽最好。对其余因素研究表明，护绿效果显著的因素为：发酵温度15℃，贮藏温度0℃或5℃，透光率较低的黑色玻璃瓶。4.总结本文阐述了叶绿素的理化特性，变色机理以及防护措施；研究了不同护绿剂、发酵温度、贮藏温度、不同透光率的容器对猕猴桃酒护绿的影响，分别测定并比较了猕猴桃酒中叶绿素、类胡萝卜素的含量，并将其含量与猕猴桃酒色泽相关联，分析推测了猕猴桃酒护绿的较佳组合。主要结论如下：（1）最佳护绿剂浓度为：Ca2+（CaCl2）800mg/L、Zn2+（醋酸锌）30mg/L、EDTA-2Na40mg/L、Cu2+(硫酸铜)2mg/L。（2）护绿效果显著的因素为：发酵温度15℃，贮藏温度0℃或5℃，透光率较低的黑色玻璃瓶。（3）光照对猕猴桃酒制品的护绿效果影响最显著。（4）在15℃下酿制的猕猴桃酒感官评价最好。参考文献[1]布坎南B,格鲁依森姆W,琼斯RL.植物生物化学与分子生物学[M].北京:科学出版社,2004:466