小碱与蛋白质的相互作用研究

小碱与蛋白质的相互作用研究

1药物与血清白蛋白的相互作用茴香碱（俗称黄连素）主要存在于异羟色胺类、罂粟科、毛茸茸和脱氧核糖属植物中。临床上常用作抗菌药,疗效显著。随着近些年的深入研究,发现小檗碱在抗炎、抗肿瘤、降血糖以及治疗心血管系统疾病方面都有显著作用。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,是血液总渗透压的主要调节物质。它的另一作用是在血液循环中作为许多内源性和外源性的仓储及转运分子,能与代谢物、微生物、金属离子及药物等分子结合。研究药物与血清白蛋白的结合过程,有助于了解药物在体内的转运及代谢过程,有利于药物的开发研究与临床使用。目前,研究药物与血清白蛋白相互作用的手段主要有光谱法、毛细管电泳法、平衡透析法和核磁共振技术。徐倩等利用荧光光谱法和分子以接研究了4种黄酮与BSA的相互作用,确定了它们之间的结合常数和结合位点。吴鸿伟等采用毛细管电泳技术,研究了盐酸普罗帕酮与人血清白蛋白的结合作用机制。随着NMR技术的不断发展,应用NMR研究药物与蛋白的结合作用逐渐受到关注。与其它方法相比,NMR具有独特优点,如样品预处理简单、非侵入性、重复性好等;此外,它不仅能提供药物和血清白蛋白的结合部位和结合强度信息,而且还能通过弛豫时间等核磁参数得到药物与蛋白结合的动力学及空间构象变化情况等。赵长春等利用紫外和荧光光谱技术研究了小檗碱与人血清白蛋白的相互作用机制。曾晓蕾等通过色谱法研究了盐酸小檗碱与BSA的结合作用,得到了结合常数等信息。然而,小檗碱与血清白蛋白结合的结构特征及结合位点数至今还不清楚,其结合动力学还需进一步研究。本研究采用NMR研究小檗碱与BSA的相互作用,通过小檗碱化学位移和弛豫时间的变化情况阐述BSA与小檗碱相互作用的结构特征;根据小檗碱自扩散系数求得小檗碱对BSA的表观解离常数Kd及结合位点数n,从而明确了小檗碱与BSA结合的强度及结合部位等信息。2实验部分2.1酸度计、小碱、koBrukerAVANCEIII600型高分辨核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司);AB135-S/FACT型电子分析天平(瑞士MettlerToledo公司);酸度计(瑞士MettlerToledo公司)。小檗碱(纯度>98%,Sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司);D2O(99.9%氘代,剑桥同位素实验室);固体NaH2PO4和Na2HPO4(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);纯水由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备。2.2实验方法2.2.1小碱与bsa摩尔浓度比的筛选配制0.2mmol/LBSA-磷酸盐缓冲液(pH7.4),分别与不同浓度的小檗碱混合,配制成含小檗碱与BSA摩尔浓度比分别为10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,60∶1,80∶1,100∶1和160∶1的混合溶液,分别加10%重水锁场,加TSP定标。另外配制含2mmol/L小檗碱磷酸盐缓冲液(pH7.4)作为小檗碱1HNMR谱的结构归属,所配溶液分别装入5mm核磁管进行NMR实验。2.2.2信噪比s/n的测定NMR实验均在质子频率为600.13MHz的BrukerAVANCEIII600型高分辨NMR谱仪上完成的,实验温度控制在298.0K。1HNMR谱采用90ue84aSymbolpB@脉冲序列完成,采样点数32K,空扫次数4次,对不同浓度的样品,累加次数和增益进行适当调整,以求得到较好的信噪比(S/N)。1HT1(自旋-晶格弛豫时间)的测定采用反转恢复法来实现,脉冲间隔时间4s。在NMR实验中,谱宽12000Hz,采样点数32K。傅立叶变化前加窗函数LB=0.3增强信噪比。将谱峰的积分面积按照单指数衰减函数关系式拟合,得到各质子的纵向弛豫速率:A(t)=A0-[A0-A(0)]exp(-R1t),其中A(t),A(0)和A0分别是在恢复时间t,0和热平衡时的谱峰积分面积。而自扩散系数测量采用LED-BBP脉冲序列实现,谱峰面积按照双指数衰减函数关系拟合,得到各谱峰的自扩散系数D:A(b)=A(0)exp(-bD),b=(2rδG)2(Δ-δ/3)2(1)其中γ是氢质子的旋磁比,δ和G是脉冲场梯度的作用时间和强度,Δ是有效扩散时间,A(0)和A(b)是施加脉冲场梯度前后时信号强度。3结果与讨论3.1小碱的1hnmr小檗碱的结构式如图1所示。借助于1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY和HMBC等NMR技术,并结合MestNova软件模拟和文献,对小檗碱的1HNMR进行了归属。即:δ4.09和4.05分别为16和17位甲基,δ3.18的三重峰为5位的亚甲基质子信号,δ6.07的单峰为15位的亚甲基质子信号,δ6.89,7.30,8.29和9.59分别为4,1,13和8位的CH,而δ7.95和7.82的二重峰为11和12位的CH。δ4.82处的峰为水质子信号,小檗碱中的6位亚甲基信号与水峰信号重叠,故未观察到该质子峰的存在,如图1所示。3.2药物与蛋白的相互作用通过药物小分子的NMR参数改变可以判别药物配体与蛋白受体的结合情况。化学位移反映的是核周围电场及电子云分布状况,当药物与靶蛋白结合后,药物核周围的化学环境会发生改变,因此可以通过检测药物化学位移的改变及峰型研究结合作用。另外,1HT1也是研究药物与蛋白结合作用的常用NMR参数。当药物与蛋白形成配合物时,结合态药物分子的1HT1与游离态药物相比明显缩短。因此,通过对配体弛豫时间的观察也能预测配体与受体的结合作用。本研究通过检测2～32mmol/L小檗碱化学位移及其1HT1的变化,预测小檗碱分子与BSA的结合作用。3.2.1小碱浓度对其净化效果的影响在浓度恒定的BSA溶液中分别加入2～32mmol/L小檗碱,测定不同浓度时小檗碱的1H化学位移和峰型变化(如表1)。由表1可知,随着小檗碱浓度增加,各个质子的化学位移不同程度的向高场移动,这表明BSA与小檗碱分子发生了相互作用,形成了新的复合物。但是,因为该实验采用固定蛋白浓度的方法,所以化学位移不会无限向高场移动。由表1中各个质子的化学位移可知,当小檗碱浓度高于12mmol/L时,各个质子化学位移随浓度的升高而基本没有变化。此时结合态小檗碱浓度已趋于稳定,由此可以推测:当12mmol/L小檗碱与0.2mmol/L牛血清白蛋白结合时,溶液就已接近饱和状态。观察1HNMR谱可知,随着小檗碱浓度增加,各个质子的谱峰变宽,尤其是H-13,H-11,H-12,H-1和H-4质子。由表1可知,H-1,H-12和H-13等环上芳香氢化学位移随着小檗碱浓度的增加变化非常明显,尤其当小檗碱浓度从2mmol/L增加到12mmol/L时,蛋白对小檗碱的影响尤为显著;当小檗碱浓度高于12mmol/L时,BSA对小檗碱的环上芳香质子影响减弱,化学位移趋于定值。而环上的15位亚甲基质子和环外的16,17位甲基质子化学位移随着小檗碱浓度的增加变化不明显,H-15,H-16和H-17受BSA的影响很小。对于H-1,H-12和H-13等环上芳香质子,其化学位移的变化明显大于环上5和15位的亚甲基质子,即蛋白对小檗碱环上的芳香质子结合作用明显强于环上烷基质子,表明芳香质子更靠近蛋白,受蛋白的结合作用更强。另外,环上的芳香质子与蛋白的作用也较环外的16和17位甲基质子强,这可能与甲基质子所处的空间位阻大有关,阻碍了其与蛋白的结合作用。3.2.2小碱与bsa的结合HT1的影响为了研究小檗碱与BSA结合的动力学行为,本实验检测了BSA溶液中不同浓度小檗碱质子的1HT1,结果如表2所示。表2还列出了BSA不存在时溶液中小檗碱各质子的1HT1值。可以看出,溶液中没有BSA时小檗碱各质子的1HT1值都较大,BSA溶液中小檗碱各质子的1HT1值都明显变短,弛豫速率加快,直接反映了BSA与小檗碱的相互作用。而且各质子的1HT1值也随着小檗碱浓度增加而增大,这反映了结合态小檗碱浓度越来越高。小檗碱的H-11和H-12在低浓度时的1HT1值变化较大,这可能与它们受到蛋白背景峰影响较大有关。本研究中BSA的浓度保持不变,小檗碱浓度大于12mmol/L时,1HT1值趋于稳定,因此推测12mmol/L小檗碱与0.2mmol/LBSA溶液的结合达到饱和状态,生成的结合态小檗碱浓度基本保持不变。1HT1值对分子运动中的高频运动较为敏感,可以由此推断小檗碱与BSA结合的动力学情况。由表2可知,小檗碱分子上8,13,11,12,1和4位上的CH以及5和15位的CH2的质子的1HT1值随着小檗碱浓度的增加变化很小,结合1H化学位移变化,表明不同浓度下小檗碱与BSA结合的分子链运动没有发生明显变化。而环外16位甲基质子比17位甲基质子的1HT1值大,这可能因为H-16远离BSA蛋白,甲基质子由于自身内运动而表现为运动相对自由。由此推测小檗碱与BSA结合过程中,BSA使小檗碱各个质子的化学位不同程度的向高场移动,处于结合位点的质子化学位移变化大,而其它质子变化小。BSA的结合使得小檗碱各个质子的1HT1弛豫时间明显减少,质子在溶液中运动受限。BSA主要与小檗碱环上芳香质子结合,与环上及环外的烷基质子结合较弱。另外,通过对化学位移变化和1HT1值分析可知,当小檗碱浓度大于12mmol/L时,结合达到了稳态,由此推测小檗碱与BSA的饱和浓度比为60∶1。文献报道,蛋白与药物的结合,其主要原因与血清白蛋白中的色氨酸残基所形成的疏水腔有关。在小檗碱与BSA结合过程中,可能因为小檗碱中的芳香质子更易通过疏水作用镶嵌到BSA的疏水腔内部而与色氨酸中的吲哚基团结合。3.3小碱与bsa的关系在药物与蛋白受体溶液中,蛋白受体(P)与药物配体(L)及其生成的复合物(PL)存在动态平衡。假设在一定药物浓度范围内每个大分子上存在n个等同且独立的药物结合位点,而且各个结合点具有相同的解离常数Kd,则当结合反应达到平衡时,根据Kd=[P][L]/[PL],[P]和[L]分别是游离态蛋白和药物配体的浓度,[PL]是复合物的浓度)和核磁公式Aobs=AfXf+AbXb(Xb和Xf分别代表结合态和自由态配体的摩尔分数),则存在以下公式:Aobs=Af+(Ab-Af){(nCP+CL+Kd)-[(nCP+CL+Kd)-4nCPCL]1/2}/2CL(2)其中,A代表NMR参数(化学位移、弛豫时间等),b和f分别代表结合态和游离态,CP和CL分别是蛋白和药物配体的总浓度。根据式(1)拟合曲线Aobs和CL得到解离常数Kd和结合位点数n。本实验采用小檗碱自扩散系数计算解离常数和结合位点数。根据H-12的自扩散系数计算Kd和n。表3为2～32mmol/L小檗碱与0.2mmol/LBSA溶液所测得自扩散系数。根据表3的数据拟合曲线Dobs和CL的函数,得到Db和Df(其中Db为小檗碱浓度趋向于零时的自扩散系数,Df为小檗碱浓度趋向于无穷大时的值)。拟合得H-12的Db=6.764×10-10m2/s,Df=4.308×10-10m2/s。再根据式