白藜芦醇通过拮抗hpxr对利福平诱导的mdr1、蛋白表达及活性的影响

白藜芦醇通过拮抗hpxr对利福平诱导的mdr1、蛋白表达及活性的影响

怀孕醇x受体（pxr）也被称为醇醇x受体（sxr），是一个高度激活的遗传因素。下一种影响因素的基因包括异源性药物或养分的代谢功能，包括cyp450酶系c-接口-代谢酶、葡萄糖乙酸钠（urt）代谢酶和磷糖蛋白[p-gdp），以及由cyp450酶系c产生的-代谢酶、葡萄糖乙酸钠（urt）和-糖蛋白[p-rp）。编码基因为mdr1（现简称abcb1）、多药物耐心相关蛋白（mrp2、mr3、mrp4、mr5）和乳腺癌相关蛋白（bcrp）-药物转移瘤，它对药物或靶物质的吸收、分布、代谢和排泄等过程有重要影响。当配体结合和活化PXR后,PXR与DNA反应元件RXR结合成异源二聚体,形成的异源二聚体结合靶基因的PXR反应元件,增加其靶基因的转录和表达。目前多数抗肿瘤药物需经PXR靶酶/蛋白的处置方能自体内灭活清除,因此PXR的转录活化可使化疗药物自身或使合用的其他化疗药对肿瘤细胞的毒性或疗效降低。然而,这种配体活化作用可以被PXR拮抗剂所拮抗,例如,抑制PXR配体对下游靶基因MDR1的诱导表达,可逆转MDR1介导的多药耐药作用,因而PXR成为逆转肿瘤多药耐药的新靶点。目前已经报道的PXR拮抗剂包括抗肿瘤药物ET-743、酮康唑等唑类抗真菌药物、植物雌激素香豆雌酚等。白藜芦醇(resveratrol,RES),化学名称为3,5,4′-三羟基反苯二烯(3,4′,5,-trihydroxystilbene),属于非黄酮类多酚化合物,分布较为广泛,目前已在葡萄、藜芦、虎杖、花生等70多种植物中发现。1997年,Jang等在Science杂志上报道了白藜芦醇对癌症的始发、促进及发展阶段表现出的抑制作用,从而使白藜芦醇成为癌症化学预防和化学治疗领域的一个研究热点。随着对白藜芦醇抗肿瘤活性研究的不断发展和深入,已发现它对肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、胃腺癌、口腔鳞癌、白血病、卵巢癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞均有明显抑制作用。此外,Al-Abd等发现白藜芦醇还可以提高肿瘤细胞对抗癌药物(如紫杉醇)的敏感性,该作用主要与其可以降低多药耐药蛋白P-gp的表达相关。因此,本研究旨在探讨白藜芦醇能否通过PXR通路对P-gp基因、蛋白表达及活性产生影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试剂和培养基LS174T(人结肠癌细胞)细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,由本实验室保存;pSG5-hPXR表达质粒由美国德克萨斯州大学StevenKliewer教授惠赠;tk-MDR1-Luc报告基因质粒由美国匹兹堡大学谢文教授惠赠;pRL-tk内参质粒购自Promega公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司;培养基RPMI1640、胎牛血清和胰酶购自美国Hyclone公司;Lipofectamine2000和OPTI-MEM培养基购自美国Invitrogen公司;利福平(rifampicin,RIF),DMSO(dimethylsulfoxide)购自美国Sigma公司;白藜芦醇(批号:111535-200502)和酮康唑(批号:100294-200602)购自中国药品生物制品检定所;TRIzol、逆转录试剂盒DRR047A及荧光染料SYBRGreen均购自日本TaKaRa公司;P-gp抗体购自美国SantaCruz公司;GAPDH抗体购自美国CellSignalingTechnology公司。1.1.2仪器、检测方法SW-CJ-2FD型超净化工作台,苏州苏净集团安泰公司;BB16型二氧化碳培养箱,美国HERAEUS公司;XSZ-D2型显微镜,重庆光学仪器厂;LumatLB9507型管式发光检测仪,德国Berthold公司;紫外分光核酸蛋白分析仪,美国BECKMAN公司;ThermoMultiskanMK3型酶标仪,美国Thermo公司;2.0LightCycler定量PCR仪,罗氏公司;流式细胞仪,美国BECKMAN公司。1.2方法1.2.1细胞培养1.2.2给药和染色1.2.3报告中的基因活性测试1.2.4real-time1.2.5Western1.2.6罗丹明123rh123的积累实验1.2.7统计处理2结果2.1mdr1检测双荧光酶活性在瞬转入pSG5-hPXR、tk-MDR1-Luc和pRL-TK质粒的LS174T细胞给予RIF(10μmol·L-1)和RES24h后,检测双荧光素酶活性,所得各处理组细胞荧光素酶比活性结果见Fig1。RES在25和50μmol·L-1浓度组均可拮抗RIF诱导的MDR1报告基因活性,经计算差异有统计学意义(P<0.01)。且与KTZ相比,RES对PXR的拮抗作用高于KTZ。2.2hpxr细胞表达多态性检测将pSG5-hPXR全长表达质粒用脂质体瞬时转入LS174T细胞5～6h后,更换培养基继续培养24h后检测细胞中hPXR的表达,Fig2显示,在转染了hPXR的细胞中,PXRmRNA是未转染的32.2倍,PXR的蛋白水平也明显升高,证明高表达hPXR的细胞模型建立成功。2.3res对rna诱导的表达在高表达hPXR的LS174T细胞中,白藜芦醇对利福平诱导的MDR1mRNA表达的影响如Fig3,RIF可将MDR1mRNA诱导至对照组的1.8倍,同时给予RIF和RES(25和50μmol·L-1),50μmol·L-1的RES可将RIF的诱导倍数降至1.3倍,且均具有统计学差异(P<0.05),而在未转染的正常LS174T细胞中无此拮抗作用。然而,在Fig4中,正常LS174T细胞和高表达hPXR的细胞中,RES在各浓度均可明显降低RIF诱导的P-gp(MDR1)蛋白表达。2.4罗丹明133对利福平对小鼠胞内罗丹明133的增殖影响由于利福平可以增加外排转运体P-gp的表达量,从而使P-gp底物罗丹明123在细胞内的积累量降低。如Fig5所示,利福平组细胞内罗丹明123积累量下降至对照组的77.7%,同时给予25和50μmol·L-1白藜芦醇后,胞内积累量分别上升至91.7%和95.1%,与利福平组比,差异均有显著性(P<0.05)。该结果说明,白藜芦醇可以通过降低利福平对P-gp的诱导而降低P-gp的转运活性。3白导体对p-gp表达的调控作用检测肿瘤的多药耐药性(multidrugresistance,MDR)是导致临床治疗中化疗的失败,影响患者预后及生存的重要因素之一。这种多药耐药的产生主要由ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族的跨膜蛋白所引起,其中MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达是MDR产生的经典机制。PXR作为一种配体活化的转录调控因子,不仅在正常组织中表达,如肝、肠、脑、肾及免疫细胞等,而且在乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等许多人类肿瘤中表达。而众多的抗肿瘤药物,如紫杉醇等,作为PXR的配体,均可激活PXR导致MDR1的表达升高而产生多药耐药现象,降低对肿瘤的化疗效果。因此,寻找和发现新的PXR拮抗剂对抑制肿瘤治疗中MDR的产生及逆转MDR有重要作用。在研究PXR拮抗剂的作用机制时发现,抗真菌药酮康唑及其同系物(氟康唑、伊曲康唑等)可对已经与配体结合的PXR进行变构修饰,通过阻断共活化因子SRC-1与AF-2区的结合位点,产生PXR拮抗作用,进而抑制其下游靶基因MDR1及CYP3A4的转录活化和表达。植物雌激素香豆雌酚作为PXR拮抗剂对PXR的抑制作用在配体结合袋以外,采用荧光偏振体外观察香豆雌酚与PXR的AF-2位点结合,并可抑制利福平增加的PXR与SRC-1的相互作用。本研究旨在研究白藜芦醇通过PXR通路对下游靶基因MDR1的转录调控作用,在正常及hPXR高表达LS174T细胞中,检测白藜芦醇对利福平诱导的MDR1转录水平和翻译水平的影响。双荧光报告基因活性检测结果表明,25和50μmol·L-1浓度的白藜芦醇可以明显下调利福平通过激活PXR对MDR1的诱导作用,该实验提示白藜芦醇可以拮抗PXR的配体激活作用。在高表达hPXR的细胞中,给予利福平和白藜芦醇共同孵育24h,检测MDR1mRNA水平,发现50μmol·L-1白藜芦醇可以将利福平诱导作用明显降低,而在未转染PXR的细胞中未发现此作用,证明白藜芦醇通过拮抗PXR活性影响MDR1的转录过程。在蛋白水平,转染PXR与否均可使MDR1调控的P-糖蛋白水平与利福平组相比明显下降,推测两种水平中结果的不一致可能因为白藜芦醇还可以影响MDR1转录后修饰过程,从而影响P-gp蛋白的翻译。在P-gp的活性实验中,利福平由于诱导P-gp表达而使Rh123外排,在胞内的积累量降低,白藜芦醇在25和50μmol·L-1浓度时,可以将LS174T细胞中的Rh123积累量明显升高(P<0.05),此结果进一步证实白藜芦醇可以降低利福平对P-gp表达的诱导作用,从而影响P-gp的活性。整个实验中,均以经典的PXR拮抗剂酮康唑作为阳性对照组,且白藜芦醇所选取的浓度与10μmol·L-1利福平合用不影响细胞存活率。已有研究表明,反式白藜芦醇单独使用时是PXR的弱激动剂,约为10μmol·L-1利福平的1.3%,本研究结果显示白藜芦醇与PXR强激动剂利福平合用时,可以拮抗利福平对PXR的激活作用,但白藜芦醇拮抗PXR的机制是否与影响PXR与SRC-1相互作用有关还有待考察。MDR1的调控机制除了PXR外,还有CAR、NF-κB等核受体参与,因此还需进一步研究白藜芦醇是否也可以通过其它核受体调节MDR1的表达。综上所述,本研究阐明了白藜芦醇通过PXR通路对MDR1的影响,为其在逆转肿瘤药物多药耐药中的作用提供了数据,也提示了因此而产生的潜在药物相互作用的可能。LS174T细胞在含体积分数为10%胎牛血清、双抗(1×105U·L-1青霉素,100mg·L-1链霉素)的RPIM1640培养基,5%CO2,37℃常规培养。取对数期细胞接种于96孔板或12孔板,每孔5×104或2×105个细胞,待细胞覆盖率达80%后,用脂质体(LipofeetaminTM2000)瞬时转染法将质粒转入LS174T细胞中,质粒和脂质体用OPTI-MEM培养基稀释。检测报告基因活性时,将75ngpSG5-hPXR、75ngtk-MDR1-Luc和作为内参的pRL-TK质粒15ng与0.5μlLipofectamineTM2000阳离子脂质体孵育20min后加至96孔板的1个培养空孔;建立高表达hPXR细胞模型时,每孔用2μl脂质体将1.2μgpSG5-hPXR质粒转入12孔板细胞。转染后5～6h,更换含有药物的培养基,0.1%DMSO为空白对照组,利福平(RIF)为诱导组,利福平+酮康唑(KTZ)为阳性拮抗组。各组药物处理后,每孔加入25μl1×PassiveLysisBuffer(PLB),室温下振荡15～30min,将20μlLuciferaseAssaySubstrate溶液加入报告基因检测试管中,后加入20μlPLB裂解液,检测萤火虫荧光素酶活性,再加入20μlStop&GloReagent,检测海肾荧光素酶活性。每孔荧光素酶活性值用海肾荧光素酶活性进行校正,即每孔荧光素酶活性值=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。0.1%DMSO作为对照组,其他处理组的荧光素酶活性与其相比,以倍数表示表达量的高低。PCR将给予药物处理24h的细胞用PBS清洗两遍后提取总RNA,并用Takara逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA后进行荧光实时定量PCR检测。使用的引物序列为:GAPDH上游引物:5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′;GAPDH下游引物:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′;MDR1上游引物:5′-CCATAGCTCGTGCCCTTGTTAGA-3′;MDR1下游引物:5′-CGGTGAGCAATCACAATGCAG-3′;hPXR上游引物:5′-CCCAGCCTGCTCATAGGTTC-3′;下游引物:5′-CTGTGATGCCGAACAACTCC-3′。按下列条件在PCR扩增仪上进行扩增:94℃×1min→95℃×30s,58℃×30s,72℃×30s,共40个循环→95℃×10s→65℃×45s→40℃×60s。利用数据分析软件对每个样品的荧光定量PCR反应结果进行分析并自动计算出Ct值,将各个样品中MDR1的Ct值减去内参对照GAPDH的Ct值得到各自的ΔCt值,然后计算各个处理剂量重复实验3次的平均ΔCt值,再将处理组的平均ΔCt值减去对照组的平均ΔCt值,得到ΔΔCt值用于计算各相关基因表达的变化倍数。即以GAPDH为内对照,药物处理细胞后MDR1mRNA的表达水平相对于对照组的变化倍数为:2-ΔΔCt倍。blot将转染hPXR及药物处理后的LS174T细胞提取蛋白并采用BCA试剂盒定量,置-80℃保存。每次上样前99℃变性10min,以25μg每孔的量加入8%SDS胶(碧云天试剂盒)中进行电泳,电泳条件为75V,30min跑积层胶,换用120V电压继续电泳60min分离蛋白。将凝胶上的蛋白用250mA恒流电转90min至PVDF膜上后用5%脱脂奶粉进行封闭60～90min。封闭后的PVDF膜浸入按比例稀释的一抗,(GAPDH一抗按1∶1000溶于一抗稀释液,P-gp一抗按1∶200溶于一抗稀释液),4℃过夜孵育。用TBST清洗3次后的PVDF膜置于二抗中室温孵育60mi