小麦线粒体dna快速提取技术研究

小麦线粒体dna快速提取技术研究

线条是真正的遗传因子中的一个重要的遗传因子装置。它于185年发现，并于1898年命名。它包含自己的dna，具有半自治性。研究证实,线粒体DNA(mtDNA)携带具有重要生物学功能的一系列基因,这些基因不但编码了核糖体和生物氧化链上某些重要酶的部分亚基,而且与真核细胞的抗药性、细胞的生命周期、植物的胞质雄性不育,以及人类的一些疾病密切相关。如mtDNA的突变会导致氨基糖甙类抗生素致聋、线粒体基因的变异重排与人类衰老死亡密切相关等。mtDNA具有快速进化、缺少重组以及严格母系遗传等特点,并且在多数真核生物中,线粒体基因组比核基因组小,易于测序及分析,然而在植物中由于植物细胞具有细胞壁、大的液泡和叶绿体DNA的干扰,使分离难度大大增加。本研究以小麦黄化苗为材料,在总结前人方法的基础上,分析了mtDNA抽提纯化过程所涉及到的多种因素并比较了不同处理方法的优劣,旨在组建一套简捷、快速、经济的植物mtDNA抽提纯化方法体系。1材料和方法1.1材料表面小麦种子于室温下浸泡12h,HgCl2消毒,铺于有吸水纸的培养皿上,置于培养箱中避光培养,温度27℃,培养5~6d。1.2粗部分沉淀剪取黄化苗50g左右,加入3倍体积的匀浆缓冲液(50mmol/LTris-HCL,pH8.0、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、1mmol/LEDTA,pH8.0、0.1%BSA、0.6%PVP、β-巯基乙醇),用预冷的DS-200高速组织匀浆捣碎机破碎组织,经6层纱布过滤,离心管分装滤液。将滤液在2℃下3500r/min离心15min,取上清液10000r/min离心20min,弃上清液。向沉淀中加入悬浮液(50mmol/LTris-HCL,pH8.0、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP),用毛笔轻刷沉淀使之充分悬浮,重复上述离心过程,得到粗线粒体沉淀。然后向沉淀中加入10mL缓冲液(蔗糖0.3mol/L、Tris-HCl50mmol/L),终浓度为0.01mol/LMgCl2,同时加入DNaseI至终浓度20μg/mL,4℃保温1~2h(冰中)。加入EDTA至终浓度20mmol/L,中止DNaseI反应。将此溶液小心的置于20mL0.6mol/L蔗糖溶液介质上(0.3mol/L甘露醇、50mmol/LTris-HCL、0.6mol/L蔗糖),10000r/min离心20min,所得的沉淀为较纯的线粒体。1.3活性化合物的合成加入2mL裂解液(0.1mmol/LTris-HCL,pH8.0、50mmol/LEDTA,pH8.0、0.1mol/LNaCl、5%SDS、β-巯基乙醇)、蛋白酶K至终浓度为50μg/mL,同时加入无DNaseI的Rnase至终浓度100μg/mL,60℃反应1~2h。然后加入等体积的酚:氯仿(1∶1)缓慢摇匀,放置5min,8000r/min离心5min后再用氯仿抽提一次。加入两倍体积的无水乙醇,同时加入3μLKAC,-20℃静止20min。12000r/min离心5min,弃上清,沉淀风干后得到mtDNA。1.4样品处理和电泳试验将DNA样品溶于TE溶液中,取10μLDNA+3μL溴酚蓝点样。0.8%的琼脂糖凝胶电泳90min,电压80V。2结果与分析2.1细胞器的破碎方式真核生物细胞包含由各种膜性细胞器组成的膜性系统和细胞骨架系统,对植物来说,还具有由纤维素和半纤维素组成的高硬度的细胞壁结构。因此,分离某一细胞器时,对组织的破碎要求一定要充分,但长时间的处理也会影响细胞器的完整性。本实验材料用组织匀浆捣碎机快速破碎,通过增加匀浆液,保证多数线粒体的浸出,既达到了快速破碎的目的又保证了线粒体的完整性。2.2浮力密度的确定在提取线粒体过程中,本研究采用4次差速离心去除杂质,然后再用简易的密度梯度离心的方法得到较纯的线粒体。简易的密度梯度离心方法中蔗糖的密度(0.6mol/L)是根据线粒体的浮力密度确定的。用该方法得到的线粒体,比差速离心所得到的线粒体纯度要高得多,虽比密度梯度离心所得到的线粒体纯度要略低一些,但更加快速、经济,尤其对于高活性线粒体的获得更为实用。由图1可见线粒体膜完整,结构清晰(这是用该方法提取的线粒体,经琼脂包埋,戊二醛和锇酸双固定,丙酮脱水,Epon812树脂包埋,LKBⅤ型超薄切片机切片,100-CXⅡ透射电镜拍照)。2.3裂解液sds的影响SDS是一种离子型去垢剂,具有极性端和非极性端,它的非极性端与跨膜蛋白的疏水区作用,取代膜脂,极性端游离于水中形成SDS-膜蛋白复合物,以便达到使膜裂解的目的。本实验比较了裂解液SDS的浓度(5%或1%)与蛋白酶K(加与不加)对裂解效果的影响,结果表明用含5%SDS的裂解液与蛋白酶K一同处理裂解效果最好。可能是因为高浓度的SDS与蛋白酶K更容易使线粒体膜裂解,利于mtDNA释放。如果提高裂解液温度至60℃,适当延长裂解时间,会使线粒体裂解的更充分。2.4裂解过程中rna的改变用纯化的线粒体提取mtDNA时,没有用DNaseⅠ处理,得到的结果如图3,从中可以看出条带有明显的拖尾,推测拖尾部分是由细胞核和质体在裂解过程中释放的DNA降解所致。在裂解前用DNaseⅠ处理后,拖尾现象消失(图2)。注意在裂解线粒体之前一定要把DNaseⅠ残余液处理干净,否则DNaseⅠ会对mtDNA产生影响。为了避免RNA的污染,实验中也可以加RNase去除RNA。RNase处理可以分为两种情况:一种是将RNase加入到裂解液中,随裂解一同进行,这种省时但处理的不彻底,最终的mtDNA会含有少量的RNA(图4);另一种是裂解后进行,这种方法费时但处理的彻底,mtDNA中几乎不含RNA(图2)。建议若提取mtDNA用于回收克隆或者酶切,必须用DNaseI和RNase处理样品以保证样品的纯度,并可适当的延长作用时间或加大酶量。若仅用于不同植物mtDNA的筛选检测,可省去DNaseI、RNase处理。2.5酚抗氧化学法在提取质粒DNA时,去除蛋白质常采用的方法是在质粒裂解后加入KAC,也有用此方法去除mtDNA中的蛋白质的,但本实验用该方法效果并不理想。我们采用了有机溶剂去蛋白的方法,且分别比较了酚∶氯仿(1∶1)一步去蛋白与酚∶氯仿(1∶1)和氯仿两步去蛋白的效果。表1为分别用两种方法去蛋白所提取的mtDNA,溶解于50μLTE后,取出2μL稀释50倍所得到的OD值。从表1中可以看出,经过酚∶氯仿(1∶1)和氯仿两次去蛋白得到的mtDNA的OD值A260/280比只经过酚∶氯仿(1∶1)处理要高,说明前者去蛋白效果更好一些。而A260/230的比值没有明显的变化。2.6ac浓度对mtnda提取的影响如果在用两倍体积的无水乙醇沉淀mtDNA的同时,再加入适当浓度的KAC,可明显改善提取效果。图5示不同KAC浓度对mtDNA提取的影响,1泳道未加KAC,2泳道加100μLKAC,3泳道加10μLKAC,4泳道加3μLKAC。从图5中可以看出,提取mtDNA时,未加KAC(1泳道)不如加入3μLKAC(4泳道)的效果好。但是,当KAC浓度过高时,对提取的效果也有明显的不良影响,如第2、3泳道。3mtnda的构建通常的mtDNA提取方法多采用经差速离心和蔗糖密度梯度离心从植物材料匀浆中分离线粒体,再将线粒体裂解后纯化线粒体DNA。这种方法可以得到纯的mtDNA样品,但此方法操作复杂,耗时长,费用高,材料需求量大。本