玻璃化冷冻对牛卵母细胞发育的影响

玻璃化冷冻对牛卵母细胞发育的影响

冷杉保存婴儿的细胞对生物材料的发展、生物资源的保护和利用以及人类辅助生殖技术的研究具有重要意义。但是冷冻后的卵母细胞会发生透明带蛋白变性,同时透明带上ZP3受体减少,使得精子穿越透明带过程受到抑制,导致冷冻解冻后卵母细胞体外受精率下降。卵母细胞胞浆内单精子注射技术(ICSI)借助显微操作将精子或精细胞注入卵母细胞质,无透明带和卵黄质对精子入卵的阻碍,且对精子的活力及完整性没有严格要求,只需要精子的基因组是完整的就可以进行操作。将ICSI技术应用于冷冻保存卵母细胞,可以更有效的保护濒危物种,充分利用猪、牛、羊等大家畜的遗传和经济价值。但是冷冻会造成卵母细胞骨架及超微结构的损伤,通过影响卵母细胞的质量,进而影响ICSI后胚胎的发育潜力。目前,应用ICSI技术对冷冻保存的卵母细胞进行受精,在人和小鼠上分别获得了46%和16.5%的受精率。牛卵母细胞玻璃化冷冻后经ICSI获得胚胎发育的报道甚少。不同成熟阶段牛卵母细胞对冷冻的耐受性存在差异,解冻后体外受精能力也有差异。但关于玻璃化冷冻不同成熟阶段牛卵母细胞经ICSI后胚胎发育的研究尚未见报道。本实验对成熟培养16h(MⅠ期)及23h(MⅡ期)的牛卵母细胞玻璃化冷冻后进行单精子注射研究,旨在摸索适于冷冻后进行ICSI的牛卵母细胞成熟培养阶段,进而提高冷冻卵母细胞ICSI的效率。1材料和方法1.1培养箱、拉针箱、煅针仪倒置显微镜和荧光显微镜(Nikon,日本),CO2培养箱(FormaScientificInc,美国),拉针仪(SUTTERINSTRUMENTCO,美国),煅针仪(Narishige,日本)。1.2实验动物牛卵巢来自河北省廊坊市大厂回族自治县的某屠宰场。1.3卵丘-卵母细胞体cos的制备和培养从屠宰厂收集成年黄牛的卵巢,保存在30～35℃生理盐水中4h内运回实验室。用37℃生理盐水洗涤3次,以带有19G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),挑选完整致密的COCs,用PBS溶液和成熟液分别洗涤2次,移入含M199成熟培养液的四孔板,置于CO2培养箱中培养(培养条件为38.5℃,100%湿度,5%CO2)。1.4大树人工卵母细胞的培养与解冻用自制小酒精灯,明火将0.25mL(France)塑料细管加热变软后拉成OPS管。OPS管壁外径为(0.23±0.01)mm,管壁厚0.08mm。在空气中冷却后用手术刀片在其细端切开,细端长度(2.5±0.5)cm。试验在38.5℃恒温台上操作,使试验用具及试剂得到充分平衡,室温为(25±1)℃。成熟培养16h或23h的卵母细胞,机械吹打使得卵母细胞周围留有2～3层卵丘细胞。将卵母细胞移入10%EG+10%DMSO溶液中平衡30s,然后移入玻璃化溶液EDFS30中平衡25s,最后卵母细胞被吸入OPS中直接投入液氮冷冻保存。每支管装5～6枚卵母细胞。解冻时将装有卵母细胞的OPS从液氮中取出后,立即将含有卵母细胞的细管部分浸入38.5℃的0.25mol/L蔗糖解冻液中,将卵母细胞从OPS中吹出并在此液中平衡3min,然后移入0.15mol/L蔗糖解冻液中平衡2min;用成熟培养液洗涤2次,形态正常者(根据细胞光泽度和膜完整性)判定为存活,移入成熟培养液中待用,并设新鲜卵母细胞为对照组。1.5离心-吹打、冷冻细管冷冻精液在38.5℃水浴中解冻30s,用灭菌滤纸吸取细管外壁水分。剪去细管两头,将精液滴入装有3mLBO洗精液的15mL离心管中,用移液器轻轻吹打混匀,置入离心机中离心8min(1800r/min),去除上清液重复洗涤1次,加入1mLBO液轻轻吹打混匀。40μL分装后-20℃冷冻保存备用。解冻时直接水浴融解即可。1.6裸卵的制备冷冻保存的成熟培养16h和23h卵母细胞,解冻后分别继续培养8h和1h(总培养时间为24h)。解冻的以及未经冷冻的新鲜卵母细胞成熟培养至24h后,用移液器轻轻吹打卵丘细胞,使成裸卵。选择形态完整、胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞准备单精子注射实验用。1.7卵母细胞和精子注射用Φ60mm培养皿的上盖制作4个60μL的液滴,依次为1∶1(V∶V)的精子稀释液和10%PVP,10%PVP液洗滴,与2个PBS操作滴。液滴上覆石蜡油。卵母细胞固定针内径为10～15μm,精子注射针内径8～10μm。注射针在PVP精子液滴中吸入1个精子后移入操作液滴,用固定针固定卵母细胞,使极体处于时针的06:00(或12:00)的位置,注射针从时针的15:00位置进针,穿过卵质膜刺入卵胞质中,回吸少量胞质,再将精子连同微量操作液注入卵胞质,然后轻轻撤出注射针,并将卵母细胞从固定针释放。1.8注射母细胞后激活注射后的卵母细胞先经7%的乙醇激活5min后移入6-DMAP中激活4h,随后将受精卵转入早期胚胎培养液中培养。1.9细胞培养胚胎激活后移入培养液CR1aa+3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)中在38.5℃、5%CO2和100%湿度的培养箱培养,48h观察卵裂并移入CR1aa+5%FBS中培养7～8d,记录囊胚数,统计囊胚发育率。1.10囊壁细胞计数囊胚细胞计数采用10μg/mL的Hoechst33342染色压片,在UV激发光下采集图像并记录囊胚细胞数。1.11统计分析显著性分析的数据均用One-wayANOVA中的LSD检验,P<0.05视为2个数据差异显著,所有数据结果用平均值±SE表示。2结果2.1月生物被孤成虫激活后的产卵及囊胚发育率由表1可知,成熟培养至24h新鲜的牛卵母细胞经过ICSI注射过程(空注),其孤雌激活后的卵裂率(84.90%)、囊胚发育率(43.39%)以及囊胚细胞数(83)与不注射的对照组(77.23%,41.58%,76)相比无显著性差异(P>0.05)。2.2冷冻组与成熟组形态正常率比较由表2可知,成熟培养23h的卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率(87.33%)显著高于成熟16h(76.66%)(P<0.05),并且冷冻组的形态正常率都显著低于对照组(P<0.05)。2.3sda检测卵母细胞中囊胚发育由表3可知,选择成熟培养16h和23h牛卵母细胞,冷冻解冻后分别继续培养到24h,ICSI并经激活后的卵裂率(69.71%、72.49%)与成熟24h新鲜卵母细胞对照组(83.73%)间无显著性差异(P>0.05);而囊胚发育率(5.29%、14.41%)均显著低于对照组(24.40%)(P<0.05)。另外,成熟培养23h的卵母细胞冷冻解冻后经ICSI获得的囊胚发育率(14.41%)显著高于16h卵母细胞(5.29%)(P<0.05)。3讨论3.1机械操作过程对牛卵母细胞发育的影响有研究认为显微注射的操作过程会影响胚胎早期至囊胚的发育,而Keskintepe等的研究证实空注与孤雌激活的牛卵母细胞囊胚发育率无显著性差异。本实验通过对成熟24h牛卵母细胞实施空注及孤雌激活对比实验表明,ICSI本身机械操作过程不会影响后期胚胎的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数,与Keskintepe等的研究结果相似。这可能是由于注射过程中注射针抽吸胞浆,造成对卵母细胞的机械刺激,充分引发Ca2+释放以及Ca2+附加峰,可以较好的激活卵母细胞,弥补了注射过程对卵母细胞造成的机械损伤的影响。3.2冷冻对石墨原螯虾支皮细胞的影响Mavrides等玻璃化冷冻体外成熟培养至MⅡ期的牛卵母细胞,解冻后进行ICSI,获得的卵裂率与新鲜对照组无显著性差异。但是Rho等玻璃化冷冻保存MⅡ期的牛卵母细胞,解冻后ICSI胚胎的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数均低于新鲜对照组。本实验结果也表明,冷冻显著降低了卵母细胞的形态正常率,且对其进行ICSI得到的囊胚率也显著低于未冷冻的对照组。导致冷冻卵母细胞ICSI胚胎发育能力下降的原因可能是在玻璃化冷冻过程中,温度和渗透压的剧烈改变以及冷冻保护剂的毒性等将导致细胞骨架及超微结构不同程度的损伤。Abe等证实纺锤体在降温过程中极易解聚,导致随后的减数分裂异常,染色体异常率增高,囊胚发育率下降。所以冷冻保存卵母细胞会影响其ICSI后胚胎的发育能力。3.3不同成熟培养阶段的牛卵母细胞解冻保存对引物外受精性的影响有实验证实不同的成熟阶段会影响卵母细胞玻璃化冷冻保存后的发育。Hochi等冷冻牛不同发育阶段卵母细胞,包括GV、GVBD、MⅠ期及MⅡ期,结果发现卵母细胞处于MⅠ期较其他发育阶段具有更高的受精率。而Lim等采用程序冷冻法分别对体外成熟培养0、6、12、18、24h的牛卵母细胞冷冻保存,解冻后分别培养至24h进行体外受精,证明MⅡ期卵母细胞解冻后卵裂率显著高于MⅠ期。本实验结果证实了成熟培养到MⅡ期的卵母细胞比MⅠ期的更适合于玻璃化冷冻保存,其解冻后ICSI囊胚发育率更高。分析其原因可能是冷冻未成熟卵母细胞会导致卵丘