rho相关螺旋卷曲蛋白激酶信号途径介导神经再生障碍

rho相关螺旋卷曲蛋白激酶信号途径介导神经再生障碍

中枢神经系统损伤后，尤其是轴突的有效再生，是中枢神经系统损伤后功能损伤的主要原因之一。影响中枢神经系统神经元与轴突再生的因素及调节机制十分复杂,但Ras同源基因-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(rashomologgene/aRho-associatedcoiledcoil-formingproteinkinase,Rho-ROCK)信号通路是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的重要途径。完整的Rho-ROCK信号通路包括:1)抑制蛋白(抑制信号):如髓磷脂相关蛋白(myelinassociatedglycoprotein,MAG)、神经生长抑制因子(neuronalgrowthinhibitor,包括Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)等。2)能够结合该抑制蛋白的受体:如Nogo受体(NgR)、配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulin-likereceptorB,PirB)、p75神经营养因子受体(p75neurotrophicreceptor,p75NTR)等。3)Rho因子。4)ROCK及5)ROCK效应分子。各种细胞外抑制信号(如Nogo-A)通过与p75NTR结合形成NgR-P75NTR复合体在胞质内传导,继而激活Rho因子,使其从无活性的Rho-GDP转变成有活性的Rho-GTP,后者进而激活ROCK,通过影响肌动-球蛋白系统导致生长锥塌陷,抑制神经细胞增殖和细胞再生。可见,深入了解Rho-ROCK信号通路的功能,对研究神经损伤后再生与修复的方法与途径等具有重要理论意义,本文对此做一简介。1nogo基因的表达1.1MAGMAG是一种跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族中唾液酸依赖的黏附分子亚族。基于不同年龄神经元的研究,发现MAG对神经元的生长是双重的,既有促进作用又有抑制作用,MAG有助于郎飞氏结(nodeofranvier)的构建,轴突细胞骨架的调整,同时抑制中枢神经系统损伤后轴突的再生。在成熟神经元中,通过提高细胞内cAMP(cyclicAdenosinemonophosphate,cAMP)的水平,MAG可抑制其突起的生长,但在未成熟神经元中,MAG则促进神经元突起生长。神经营养因子受体P75介导了MAG抑制成熟神经元突起生长的细胞内信号传导,其机制是在P75存在的情况下,MAG激活了RhoA导致生长锥的退缩。近年研究发现,外周神经损伤导致初级神经元内cAMP的水平升高,激活蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)使P75磷酸化,从而改变它在脂质层中的定位,但MAG并不与P75直接结合,而是通过神经节苷脂GT1b与P75形成共受体,MAG作用于GT1b从而间接作用于P75引起抑制性信号的传导。1.2Nogo2000年,瑞士、美国和英国的3个科研小组同时发现一种能抑制中枢神经损伤后再生的基因,将其命名为Nogo基因,它所编码的蛋白质命名为Nogo蛋白,属网状蛋白家族的成员。Nogo基因序列上的不同启动子和不同拼接使之可形成3个mRNA的转录体,它们所编码的蛋白质分别称为Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,长度分别为1163、360、199个氨基酸。其中Nogo-A只存在于中枢神经系统,主要在少突胶质细胞中表达;Nogo-B在中枢神经系统极少表达,主要存在于肺和肾;Nogo-C主要表达于骨骼肌,但在中枢神经系统也有少量表达。Nogo-A有两个发挥抑制中枢神经元轴突再生作用的肽段,一个是其独有而Nogo-B和Nogo-C不具备的细胞内氨基末端区域;另一个是三者共有的位于细胞外区的66个氨基酸环,也叫Nogo-66。进一步的研究发现,虽然Nogo-A的氨基末端具有一般的生长抑制活性,但Nogo-66的抑制作用则仅局限于神经元细胞。Nogo-A在阻止神经再生方面起抑制作用,观察中脑动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)的成年老鼠的大部分脑区域,7d及14d后的Nogo-A表达维持在中等水平,但在1~3d时,Nogo-A水平便已有较明显的上升,由于存在控制Nogo-A表达的因素,使其表达量下降恢复基础水平,而到28d,Nogo-A表达量明显增加。考虑有可能是神经元及少突胶质细胞的变性坏死、细胞数目减少造成此种现象;或许是损伤的原因及损伤持续时间不同造成了白质损伤程度的不同,进而引起Nogo-A的表达变化规律也不尽相同。此外,颅脑外伤后,脑组织常伴有机械性脑细胞破坏和血脑屏障损伤,同时脑组织血液循环及脑细胞代谢变化等进行性中枢神经系统损伤均导致细胞膜的完整性被破坏,使损伤后脑组织内的Nogo-A蛋白进入血液循环。因此,通过检测外周血中Nogo-A蛋白水平的变化,能够反映脑组织损伤的严重程度。1.3OMgpOMgp是中枢神经系统白质内的一种特异性糖蛋白,含有433个氨基酸残基,有4个结构域,N末端有一个富含半胱氨酸的短基序,富含亮氨酸的区段(LRR)可能在与NgR结合中起作用,与O-糖基位点结合的富含丝/苏氨酸的区段以及疏水的C-末端,LRR区高度保守,可能在髓鞘形成的过程中与终止信号的发出有关。OMgp对轴突生长的抑制作用和诱导生长锥塌陷主要是通过与NgR及与其相连的受体复合体特异性结合,通过第二信使cAMP激活RhoA实现的。YKoyama等在研究面神经损伤后OMgp的表达情况时发现,在面神经损伤后1h即可见OMgp的表达增强,1周后达到高峰,到3周后逐渐降低但仍高于正常对照组水平,认为这种变化可能与神经损伤后的神经回路重建有关。1.4硫糖软骨素蛋白聚糖硫糖软骨素蛋白聚糖(chondroitinsulfateproteoglycans,CSPGs)是由少突胶质细胞前体细胞及反应性星形胶质细胞产生的,关于成年老鼠的脊髓损伤的实验证明,中枢神经损伤后CSPGs会在局部引起胶质反应形成胶质瘢痕,对神经再生形成屏障作用。CSPGs是中枢神经再生抑制物质最有力的实验证据是,应用软骨素酶能明显增强成年大鼠损伤后中枢神经的再生。2pirb影响髓案件的机制2.1NgRNgR为糖基醇磷脂结合蛋白,含473个氨基酸残基,氨基端有1个信号肽,其后为8个富含亮氨酸的重复区,羧基端含丰富的半胱氨酸,与糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatedylino-sitol,GPI)相连。实验表明,中枢神经系统髓磷脂中另外两种轴突生长抑制蛋白-MAG与OMgp,都通过NgR及与其相连的受体复合物发挥作用。人类的NgR与小鼠的NgR有89%的同源性,其基因的外显子位于22q11染色体上。NgR在中枢神经系统中分布广泛,灰质中含量较高,大脑皮质、海马、脑桥、小脑蒲肯野细胞也有分布,但不存在于少突胶质细胞,外周组织中只有心脏和肾脏有极少量的分布。经试验观察,在老鼠的胚胎脊髓中,发现Nogo-A可以在少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyteprogenitorcells,OPCs)、少突胶质细胞、神经细胞前体细胞(neuralprecursorcells,OPCs)中检测到,OMgp可以在OPCs、少突胶质细胞中检测到,MAG只能在少突胶质细胞中检测到,NgR能在OPCs及NPCs中检测到。这些结果提示,MAG和NgR在OPCs中的表达因素完全不同于少突胶质细胞,可能是这两种细胞在促进神经突再生方面不同作用的一个因素。在增殖的环境中,Nogo-A、OMgp及NgR在OPCs中的表达,作用是控制突起的长度,因此对OPCs的形态起到维持作用;而在分化的环境中,Nogo-A、OMgp及NgR在OPCs中的表达,作用是促进细胞的分化、成熟。以NgR为靶点促进脊髓损伤后神经功能的恢复是目前临床上一个重要手段。YSu等研究发现Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C基因敲除鼠视神经损伤后轴突生长明显比未行基因敲除的小鼠活跃,对NgR基因敲除鼠进行在体和离体实验,同样发现NgR基因敲除鼠视神经损伤后其神经节细胞可以再生。2.2PirB配对免疫球蛋白样受体B(pairedimmunoglobulin-likereceptorB,PirB)是新发现的一种新型髓鞘抑制因子受体,Nogo、MAG、OMgp也可通过与PirB结合而发挥轴突生长抑制作用,引起神经退行性病变。PirB基因编码蛋白为跨膜免疫蛋白分子结构,包括胞外端的6个IgG样结构域、跨膜区、以及胞内端的ITIM,其氨基酸序列与人类基因组的ITIL3和ITIL4有超过60%的同源性,属于同一家族的免疫信号分子,通过胞外端的IgG样结构域与来自胞内和胞外的其他分子结合,激活其胞内端ITIM基序,传导抑制信号,起到对免疫反应的调节作用。PirB在正常脊髓神经组织中表达很少,而损伤的脊髓则表达明显增加,并随损伤时间的延长表达进一步增加。YFujita等发现,Src的同源1的酪氨酸蛋白磷酸酶(Srchomology1-containingproteintyrosinephosphatase,SHP-1)和Src的同源2的酪氨酸蛋白磷酸酶(Srchomology2-containingproteintyrosinephosphatase,SHP-2)通过PirB的作用上调MAG的盲点,作为酪氨酸激酶受体(tyrosinereceptorkinase,Trk)酪氨酸磷酸酶的功能。甚者,SHP-1和SHP-2的抑制可以减少MAG诱发的Trk受体脱磷酸化和去除MAG在突触生长上的抑制作用。但在神经元上,PirB与TrK通过SHP-1/2一起下调基底节与神经递质TrK的活性;在视神经损伤的大鼠体内,通过SHP-1或SPH-2的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的转染可诱发轴索的变性。2.3P75P75是肿瘤坏死因子受体I(tumornecrosisfactorreceptorI,TNFRⅠ)家族中的一员,分布广泛,且能与神经生长因子、脑源性神经生长因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)等诸多神经营养因子以低亲和力结合。由于Nogo-66的受体(NgR)是GPI结合蛋白,没有胞内信号区域,因此需要一共受体的存在。P75是一种跨细胞膜的神经营养素受体,其胞质部分与Rho作用,而Rho能介导髓磷脂对轴突生长的抑制作用,所以P75被认为是NgR的协同受体。P75也参与PirB的信号传递,通过两种受体之间的配体结合,抑制轴突的再生。但是实验发现,去除两种受体之间的配体结合因素,并不能加强脊髓损伤后的轴突再生作用。3rac和cdc42在细胞生长和生理中的作用小分子GTP酶Rho家族属于ras超家族成员,与ras超家族蛋白有25%的同源性。Rho是GTP酶Rho家族中的一种小分子单体GTP结合蛋白,其分子量为20~30kDa。自1985年Rho首次发现以来,人类GTP酶Rho家族共有大约6个亚族及26种相关分子得到证实。Rho家族蛋白由Rho(RhoA、RhoB和RhoC)、Rac(Racl、Rac2、Rac3和RhoG)、Cdc42(Cdc42Hs、G25K和TC10)、Rnd(RhoE/Rnd3、Rndl/Rho6和Rnd2/Rho7)、RhoD和TTF亚型构成。其中,RhoA、Rac和Cdc42是Rho蛋白亚家族中最有代表性的,它们在轴突外生中起重要作用,RhoA与Rac/Cdc42在神经细胞生长过程中的作用是相反的。CNS损伤后Rac和Cdc42的活化引起丝状伪足和层状足板的形成,然而RhoA的激活与生长锥的溃变以及生长抑制相关。一般而言,RhoA是树突生长的负性调节因子,例如,活性RhoA突变体的表达可以严重缩短树突的长度;而Racl在调节细胞骨架、细胞转录、分泌和凋亡方面均发挥着重要的作用。在静息的细胞中,Rac存在于细胞质中,与核苷酸解离抑制因子(nucleotidedissociationinhibitiors,RhoGDIs)以复合物的形式存在,一旦细胞受到刺激,Rac-Rho-GDI复合物立即发生解体,鸟苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactors,RhoGEFs)介导Rac由无活性的GDP状态向有活性的GTP状态转变,从而引发下游一系列的级联反应。Racl可以通过直接激活p21-活性激酶(p21-activatedkinase,PAK)来影响肌动蛋白细胞骨架和微管的发生与发展;同时,GTPaseRacl在神经突触向外生长的过程中可以调节下游的周期性依赖蛋白激酶(cyclindependentkinase5,cdk5)和神经特异性调节因子p35的定位与活性从而间接作用于PAK,Racl通常直接作用于p35进而影响cdk5,干扰被持续激活的PAK的活性。因此,Racl在激活PAK的同时,还可以通过p35、cdk5抑制PAK的活性,使其维持在一个相当稳定的状态,从而促进新突触的形成与巩固。髓磷脂相关抑制因子(myelinassociatedinhibitionfactors,MAIFs)还能促进p75神经营养因子受体(p75neurotrophicreceptor,p75NTR)与RhoGDIs的结合,使Rho-GDP释放,在RhoGEFs的作用下,形成Rho-GTP而激活。4克氏激酶rho-gtp和利用人体内的c端结构ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,以两种同源性极高的异构体存在:ROCKⅡ(ROCKα)和ROCKⅠ(ROCKβ)是目前研究最为清楚的Rho下游效应分子。Rho激酶包括一个催化区(位于分子结构的N端),一个螺旋区(位于分子结构的中间部分)及一个pleckstfin同源区(PH区,位于分子结构的C端)。Rho激酶的Rho结合区(Rho-binding,RB)位于螺旋区的C端。Rho-GTP与螺旋区的C端相互作用,并激活Rho激酶的磷酸转移酶活性。Rho激酶的C端(包括RB和PH区)为激酶的负向调节区。在静息状态下,RB和PH区与激酶的催化区相互作用,并抑制激酶的活性。激活状态的Rho与RB相互作用,改变了Rho激酶的构型,从而解除RB和PH区对激酶的抑制,Rho激酶被激活。激酶缺失C端区,包括PH区或PH与螺旋区,可使激酶持续激活。将C3转移酶用于老鼠的神经和脊髓的损伤部位抑制RhoA,发现其轴突和皮质脊髓束的纤维明显增生。体外实验发现,ROCK的抑制因子Y227623能逆转髓磷脂引起的轴突再生抑制,体内实验表明它能促进轴突的再生和运动功能的恢复,这些都表明ROCK是RhoA的效应器。Y227632作为ROCK的主要抑制剂,对各种原因导致的神经损伤均具有保护作用,可增加神经元细胞的存活和神经突起的延长,Y227632与CNTF(另一种ROCK抑制剂)联合使用更有利于神经突起的生长和再生,并有望用于临床治疗各种神经损伤及退行性病变。5rho激酶抑制剂mlcp治疗轻链带亚基亚基当Rho/Rac