铁皮石斛组织培养研究进展

铁皮石斛组织培养研究进展

剥皮科又称石斛科多年生附生草本植物，又名剥皮科兰科，为黑色杂生草本植物。茎的节很黑，所以它是一个黑节草。铁皮石斛是我国传统的名贵中草药,其化学成分为石斛多糖(高达21.7%)及石斛碱。《中国药典》收录3种石斛原植物,铁皮石斛是之中最珍贵品种,具有滋阴清热、养胃生津、润肺止咳等功效,其所含的多糖成分具有增强人体免疫功能、防癌抗癌、恢复嗓音等功效。由于铁皮石斛对生长环境的要求较高,且受到自身繁殖方式的限制及近年来过度采挖野生药材和整体生态环境的不断破坏,野生铁皮石斛资源已接近枯竭。鉴于此,利用组织培养进行大量繁殖生产,既能发挥其药用价值,又能使这一濒危植物得到保护和发展[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。本文综述了近年来铁皮石斛组织培养的研究进展,以供参考。1自然生长条件和繁殖1.1石料苔藓植物群落铁皮石斛生于海拔2100-2500m的林中树上或林缘岩石上,或在河沟、沟溪山谷旁峭壁上,并常与石苇等苔藓植物附生在一起,在我国主要分布于广西、云南、贵州等地,喜阴凉、湿润、通风多雾的小气候。石斛在14℃时开始生长,20-26℃且空气湿度>80%最适宜;在30℃且相对湿度<50%的情况下,叶脉变黄,叶片下垂,茎现皱缩,如崖缝渗水过多则易烂根致亡。石斛喜光又怕强阳光直射,忌干燥与高温。1.2发酵温度对铁皮石斛的影响铁皮石斛的有性繁殖极为困难,主要原因包括:(1)其种子极为细小,胚胎发育不完全,无胚乳组织,在自然状态下发芽率极低。(2)苛刻的生长环境,也限制了其有性繁殖。何平荣等研究表明,铁皮石斛平均自然结实率为0.31%。铁皮石斛主要靠根部无性分蘖繁殖而不断生出新的植株并成丛生长,有时也从上部茎节处生根长出新植株。2组织培训2.1培养基生长情况对铁皮石斛种子无菌萌发及发芽率的研究表明,铁皮石斛种子可在1/2MS、改良KC、改良N6、N6、VW培养基上生长,且最高萌发率可达100%,最低萌发率为6%。多数研究表明其萌发率较好[5,6,7,8,9,10,11,12]。2.2外植体诱导器官的出现研究表明,用铁皮石斛的茎段能很好地诱导器官发生,也可用根尖、茎尖、不定芽、蒴果、幼叶、根蔸诱导器官发生。2.3诱导供养及培养原球茎袁正仿等将铁皮石斛带茎节的茎段接种于培养基上(N6+2.5mg·L-1BA)诱导茎节发芽,再将芽接种于培养基上(N6+2.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1IBA)诱导出原球茎,并指出只有将诱导出的小植株再诱导,诱导出大量的原球茎,才能扩大其繁殖。秦廷豪用铁皮石斛茎段、带顶芽的茎段和根蔸3类外植体在培养基上(MS+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA)培养,仅根蔸能诱导出原球茎。王春等研究表明,铁皮石斛原球茎诱导最佳培养基为1/2MS+1.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA,诱导率为58%。王丽萍等研究表明,选用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体诱导出原球茎的最佳培养基为MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-12,4-D。郑宽瑜等以铁皮石斛种子为外植体诱导出原球茎。苏钛等研究表明,BA相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好,以2.0mg·L-1BA诱导率最高。2.4最佳培养基的确定周俊辉等研究表明,以1.0mg·L-1NAA诱导铁皮石斛生根效果最明显。袁正仿等将铁皮石斛原球茎接种在分化培养基上(N6+1.5mg·L-1BA+1.2mg·L-1NAA+5%香蕉汁)诱导原球茎分化,结果表明,添加一定浓度的土豆汁、香蕉汁有利于原球茎分化,且添加浓度直接影响分化率和分化时间;用N6+2.5mg·L-1NAA+10%香蕉汁培养基使苗快速长高,把长高的苗转接到培养基上(N6+2.5mg·L-1NAA+10%土豆汁),使茎变得粗壮。徐雪荣等研究表明,铁皮石斛原球茎最佳分化培养基是MS+0.3mg·L-16-BA+3.0%白糖,分化率为74%;分化出的丛芽接种在生根培养基中(MS+0.05%AC+3.0%白糖),28d生根率达到87%。朱艳等研究表明,铁皮石斛丛生芽在培养基上(1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC)生根效果最好。林丛发等研究表明,最适于铁皮石斛原球茎分化的培养基是1/2MS+0.5mg·L-1NAA+20%马铃薯汁+20g·L-1蔗糖+0.8g·L-1琼脂。王春等研究表明,铁皮石斛不定芽最佳生根培养基为1/2MS+0.5mg·L-1NAA,生根率为100%,平均生根数为7.1条。2.5铁皮石斛原球茎鲜重与干重增长的变化韩晓红等研究表明,液体悬浮培养能显著提高原球茎的增殖率。魏小勇在建立的铁皮石斛原球茎增殖的悬浮培养体系中,发现铁皮石斛原球茎鲜重与干重增长都最快。宋经元等研究表明,铁皮石斛原球茎鲜重与干重在液体培养基上均极显著高于固体培养基。褐变是液体悬浮培养中的限制因素,在悬浮培养时加入较高浓度的抗氧化剂Vc可以防止原球茎出现褐变。2.6u3000脂石斛在花芽诱导中的应用王光远等报道了铁皮石斛试管开花,李璐进一步比较了6-BA和TDZ对铁皮石斛试管花芽诱导的影响,并指出使用TDZ诱导试管苗花芽更容易得到正常的花芽,诱导其试管开花最优培养基为:1/2MS+0.2mg·L-1TDZ+100mg·L-1CW+20g·L-1白糖。2.7影响铸铁板岩组织培养的因素2.7.1培养基对铁皮石斛壮苗生根的影响目前,铁皮石斛组织培养所用的培养基根据不同生长阶段而异。1/2MS、MS和KC等培养基都适合原球茎增殖;刘骅等研究了1/2MS、B5、VW、KC培养基对铁皮石斛壮苗生根的影响,结果表明,B5和1/2MS较适宜铁皮石斛的壮苗培养;李璐等研究表明,1/2MS培养基适宜铁皮石斛壮苗生根培养,而且是诱导铁皮石斛试管开花的最优培养基。2.7.2铁皮石斛原球茎的增殖目前,铁皮石斛组织培养中常使用的外源激素主要是生长素类(如IAA、IBA、NAA等)和细胞分裂素类(如BA、ZT和KT)。不同生长发育阶段所需激素的量和种类都不尽相同。唐桂香等研究表明,1.0mg·L-1BA和0.1mg·L-1NAA有利于铁皮石斛原球茎增殖;蒋波等研究表明,2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA或3.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA适宜铁皮石斛原球茎增殖。莫昭展等研究表明,在改良MS中加入0.5mg·L-1ABA,原球茎增殖的效果比较好。刘骅等研究表明,2.0mg·L-1NAA对铁皮石斛的壮苗生根较好;唐桂香等研究表明,0.5mg·L-1NAA对铁皮石斛的生根效果最好。李璐比较了6-BA和TDZ对铁皮石斛花芽诱导的影响,结果表明,0.2mg·L-1TDZ最适宜诱导其开花。2.7.3椰子汁、苹果汁对铁皮石斛原球茎的增殖椰子汁、香蕉泥、苹果汁、马铃薯汁等添加物对铁皮石斛组织培养过程中有重要影响。椰子汁、苹果汁对铁皮石斛原球茎增殖有较好的效果,刘炜婳等研究表明,添加50g·L-1香蕉泥可使增殖的原球茎大而健壮,颜色浓绿,分化程度较低,且紧密程度较好。香蕉泥、苹果汁、马铃薯汁、椰子乳也都能促进铁皮石斛的壮苗生根。2.7.4对原球茎的生长蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂,对原球茎的生长影响较大,冯莹等研究表明,白糖对原球茎的培养效果优于蔗糖,以20g·L-1白糖效果最好。2.7.5ph值pH值影响细胞的透性、代谢和培养物的生长与分化。陈青青等研究表明,pH值对铁皮石斛的苗鲜重和生根率有显著影响,以pH5.4为宜。2.7.6x时铁皮石斛的生长陈青青等研究表明,温度和光照对铁皮石斛的生长影响显著,在25℃、光照强度为1500lx时,最适宜铁皮石斛生长。鲍顺淑等研究了不同光照时间对铁皮石斛组培苗生长发育的影响,指出光照时间为12h·d-1时,组培苗的净光合速率和叶绿素含量较高,干重和腋芽数增加较多,表现出良好的生长与繁殖能力,因此,铁皮石斛组培苗的适宜光照周期为12h·d-1。3时间和稳定性研究目前,铁皮石斛在组织培养方面已经取得很大的进展,并已应用于生产,这对濒临灭绝的野生铁皮石斛资源有缓解作用。当前铁皮石斛价格昂贵,供不应求。如何缩短其生长周期,且提高药用成分含量是解决铁皮石斛大规模生产的关键